選擇重組蛋白表達的合適方法（二）

三、畢赤酵母

酵 母 作 為 另 一 種 表 達 重 組 蛋 白 的 強 有 力 的 傳 統 工 具 ，已 被 成 功 應 用 于 大 量 蛋 白 質 的表 達 。酵 母 既 具 有 大 腸 桿 菌 的 許 多 優 點 ，如 增 殖 時 間 短 、基 因 組 易 于 操 作 ，又 具 有 真 核 生物 的 優 勢 ，包 括 改 善 的 蛋 白 質 折 疊 的 能 力 和 大 部 分 的 翻 譯 后 修 飾 能 力 。第 一 個 常 規 應 用于 重 組 蛋 白 表 達 的 酵 母 菌 株 是 釀 酒 酵 母（SaccAarow^yces ceretw』 siae) (Strausberg andStrausberg, 2001)。然 而 ，近 1 5 年 來 ，畢 赤 酵 母 (Pz’ c/iia和u ‘ f o r k ) 已 經 成 為 酵 母 的 首選 , 因 為 該 菌 株 重 組 蛋 白 的 表 達 水 平 高 于 釀 酒 酵 母 (詳 見 第 1 3 章）。畢 赤 酵 母 是 甲 醇 營 養型 酵 母 (methyltropic yeast), 可 利 用 甲 醇 作 為 其 唯 一 的 碳 源（Cregg et al. , 1985)。畢 赤酵 母 在 含 甲 醇 的 培 養 基 中 生 長 ，會 導 致 其 醇 氧 化 酶 (alcohol oxidase，A 0 X )和 二 羥 丙 酮 合酶 (dihydroxyacetone synthase)基 因 發 生 強 烈 的 誘 導 轉 錄（C r e g g ，2007)。經 過 誘 導 ，這些 蛋 白 質 可 以 占 到 畢 赤 酵 母 總 生 物 質 的 3 0 % 。研 究 人 員 將 醇 氧 化 酶 I (A O X l ) 的 嚴 密調 控 的 強 啟 動 子 整 合 入 大 部 分 重 組 蛋 白 表 達 質 粒 用 來 驅 動 重 組 蛋 白 的 表 達 ，已 經 實 現 了對 該 甲 醇 依 賴 基 因 誘 導 作 用 的 利 用（Daly and H e a m , 2005)。畢 赤 酵 母 的 表 達 載 體 會 整合 到 基 因 組 中 ，而 釀 酒 酵 母 的 表 達 載 體 是 游 離 復 制 (replicating episomally)的 質 粒 型 表 達載 體 ，這 種 載 體 很 不 穩 定 。利 用 畢 赤 酵 母 評 估 重 組 基 因 的 表 達 需 要 3? 4 周 ，這 包 括 酵 母的 轉 化 、篩 選 陽 性 整 合 的 轉 化 子 和 蛋 白 質 的 表 達 所 需 的 時 間 。畢 赤 酵 母 一 個 能 打 動 人 的優 點 是 其 在 合 適 的 培 養 條 件 下 能 夠 獲 得 極 高 的 細 胞 密 度 (C r e g g , 2007)。只 需 使 用 成 本低 廉 的 培 養 基 ，畢 赤 酵 母 就 能 達 到 120 g /L 的 細 胞 干 重 密 度 。需 要 重 點 注 意 的 一 點 是 ，誘導 用 培 養 基 中 需 要 含 有 低 百 分 比 的 甲 醇 ，在 大 規 模 培 養 中 ，甲 醇 的 量 達 到 了 產 生 火 災 風 險的 程 度 ，需 要 采 取 更 高 一 級 的 安 全 措 施 。

畢 赤 酵 母 已 經 用 于 獲 取 胞 內 和 分 泌 表 達 的 蛋 白 質 。與 其 他 真 核 生 物 一 樣 , 它 可 以 有效 地 形 成 二 硫 鍵 ，而 且 已 經 成 功 用 于 表 達 含 有 多 個 二 硫 鍵 的 蛋 白 質 。為 了 便 于 分 泌 表 達 ,必 須 對 重 組 蛋 白 進 行 改 造 以 使 其 攜 帶 信 號 肽 序 列 。最 常 用 的 信 號 肽 是 釀 酒 酵 母 的 cr交配 因 子 (a-mating factor)的前-原(pre-pro)序 列（Daly and H e a r n , 2005)。 由 于 畢 赤 酵 母只 分 泌 很 少 的 內 源 性 蛋 白 ，從 培 養 基 中 純 化 重 組 蛋 白 是 個 相 對 簡 單 的 工 作 。如 果 重 組 蛋白 的 酶 解 比 較 嚴 重 ，可 以 利 用 Pep4 蛋 白 酶 缺 陷 型 畢 赤 酵 母 菌 株 進 行 表 達 (Gleeson et al. ，1998)。該 菌 株 具 有 較 低 的 液 泡 肽 酶 A (vaCU〇 k peptidase A )活 性 ，該 酶 負 責 活 化 羧 肽 酶Y(carboxypeptidase Y )和 蛋 白 酶 B K p r o t e a s e B I ) 。

酵母具有翻譯后在特異的天冬酰胺殘基(N-連接)和絲氨酸/蘇氨酸殘基(〇■連接)添加聚糖 (glycan)的能力。這些聚糖的結構與昆蟲和哺乳動物細胞修飾添加的聚糖的結構是很不相同的。在畢赤酵母中，N-連接的聚糖是高甘露糖(mannose)型 的 ，通 常 有 8?17個甘露糖，而釀酒酵母聚糖含有50?150個甘露糖殘基(Celik et al. ， 2007; Gemmill andTrimble, 1999)。與昆蟲和哺乳動物細胞相似的是，在 酵 母 中 N-連接聚糖的一致序列是Asn-Xaa-Ser/Thr。有兩個研究小組已經通過全面的工程改造獲得了兩個畢赤酵母的菌株 ，它們能夠產生可以與哺乳動物細胞中相媲美的復雜的 N-連 接 聚 糖 結 構（Hamiltonand Gerngross, 2〇 07)。然而, 其他研究人員只能使用Roland Contreras研究小組開發的菌株，而且必須得到Research Corporation Technologies的許可。對 畢 赤 酵 母 中O■連接聚糖的結構研究還不很充分，但已知其是通過在絲氨酸/蘇氨酸殘基上添加1?4 個甘露糖殘基形成的（Goto, 2007; Trimble et al.， 20 〇 4)。已有數個報道指出，某些特定蛋白質在畢赤酵母中表達時會被添加O 連接聚糖，而在哺乳動物細胞中的內源性表達卻不會這樣（Daly and Hearn， 2005)。

四、桿狀病毒/昆蟲細胞

在昆蟲細胞中由桿狀病毒(baculovirus)介 導的蛋白質表達為重組蛋白制備提供了另外一種手段(詳 見 第 14章）。桿狀病毒是一種裂解性的（lytic) 、大的（130 k b )雙 鏈 D N A病毒 ，其中桃木菌屬(Awi呀 病 毒 是 最 常 用 于 重 組 蛋 白 表 達 的 桿 狀 病毒 。桿狀病毒通常在來源于秋天彳了軍蟲草地貪夜蛾（fall a r m y w o r m Spodoptera frugiperda )(Sf 9 、Sf 2 1 ) 的昆蟲細胞系中進行增殖, 而重組蛋白的表達既可在上述細胞系中完成，也可在來源 于擬尺罐粉紋 夜 蛾（cabbage looper Tii) 的 細 胞（H i g hFive)中進行(Kost etal. ， 2〇〇5)。起初，構建重組桿狀病毒的工作涉及將具有桿狀病毒

D N A 側翼序列的目標 基 因 與桿狀病毒的D N A 共轉染昆蟲細胞(insect cell) , 然后篩選出稀 有 的 同源重組體。重組體的鑒定是通過篩選形態改變的空斑(plaque)來 實現的，而且通常需要另外的多輪空斑篩選以確保制備的重組病毒中未污染有野生型病毒。這種耗時耗 力 的重組病毒制備方法在大多數時候已經被位點特異性轉座技術(Bac^to-Bac或 Ba c uIoDirect, Invitrogen) 和改 良 的 同源重組 技 術 (該 技 術 使 用 在 orfi62 9 含有一個致死突變的工程桿狀病毒）（來自 Oxford Expression Technologies 的 flashBAC, 或來自 E M D ——N o -v a g e n 的 B a c M a g i c ) 所取代。因為其重組效率為 100%, 這兩種方法都省略了分離空斑的操作。1 輪 或 2 輪的重組病毒擴增后，研究人員可以使用空斑分析法、更新穎更快速的實時定量 PC R法或基于抗體的分析法對桿狀病毒的濃縮液進行定量（Hitchm a n et al. ，2007; K w o n et a l .， 2〇 02)。重組桿狀病毒構建和定量方法上的進步已經極大地減少了使用桿狀病毒進行表達的時間—- 縮短至大約3 周 ，這其中包含為了優化表達而耗費的時間。

桿狀病毒表達系統中最常用的是polH 啟 動 子 和 plO啟 動 子 ，二者均能在桿狀病毒感染的晚期經誘導產生高水平的表(Ikonomou e t a l . ， 2003)。在此階段, 細胞開始死亡 ，并伴隨著蛋白酶的釋放，這些蛋白酶可能會導致重組蛋白降解。為了減少重組蛋白的酶解，已經使用了在細胞裂解周期中較早階段激活的啟動子，如基本啟動子（basic prom oter) (Ikonomou et al. ， 2003) 。 CA￡A 和1)——〇1執基因分別編碼幾丁質酶（chitinase) 及一種組織蛋白酶(cathepsin protease)，也可以通過構建二者的基因缺陷型以盡量降低蛋白質水解的作用（Monsma and Scott, 1997)。

桿狀病毒介導的蛋白質表達通常既能用于制備胞質表達的重組蛋白，又能用于獲取分泌表達的重組蛋白。高效的分泌表達一般需要信號肽的參與。昆蟲和哺乳動物的信號序列都能引導重組蛋白進入昆蟲細胞的分泌途徑。起初 ，昆蟲細胞的培養是在含血清的培養基中進行，這使分泌蛋白的純化變得復雜。近來新研發的培養基允許使用動物組織或植物組織的蛋白質水解液代替血清，從而大大簡化了蛋白質的純化 (Ikonomou et al. ，2003)。不過 ，這種特殊的培養基造價高昂，限制了它在大規模生產中的應用。

昆蟲細胞能有效地在重組蛋白中形成二硫鍵，也能進行絕大部分發現于哺乳動物細胞的翻譯后修飾。然而，大部分昆蟲細胞中形成的JV-連接聚糖都是巖藻糖苷寡甘露糖(fucosylatedpaucimannose)結 構（Man3 GlcNAc2-N-A sn) (H arrison and Jarvis, 200 6;Jenkins e ta l. ，1 9 % ) 。這一發現促使人們于最近構建了能夠產生含有常見于哺乳動物細胞中的復雜N -連接聚糖的糖蛋白的昆蟲細胞系（Harrison and Jarvis, 2006)。一個能夠表達數種糖基轉移酶的轉基因 S f-9 昆 蟲 細 胞 系 已 實 現 了 商 業 化（Mimiccelllin eInvitrogen), 其產生的 N -連接聚糖包含一個雙觸須樣唾液酸化(sialylated)結構。目前僅有幾篇文獻描述了昆蟲細胞產生的O 連接聚糖的結構(Chen et a l . ， 1991; Sugyiama eta l . ， 1993; Thomsen et a l . ， 2004)。