試劑的制備
單層培養細胞的透化
懸浮培養細胞的透化
用分離的亞細胞組分分析蛋白質的磷酸化
用分離的亞細胞組分進行激酶分析
| 試劑、試劑盒 | 胞外緩沖液 胞內緩沖液 透化緩沖液 標準裂解緩沖液 裂解緩沖液 SDS-PAGE 加樣緩沖液 雙向-PAGE 裂解緩沖液 |
|---|---|
| 實驗步驟 | 這些試劑在后面許多地方要用到，應在進行下述實驗前配好。 1. 胞外緩沖液（pH 7.2，37℃） 110 mmol/L NaCl 10 mmol/L KCI 1 mmol/L MgCl2 1.5 mmol/L CaCl2 30 mmol/L HEPES 10 mmol/L 葡萄糖 過濾滅菌，4℃ 保存可達 1 個月。 2. 胞內緩沖液（pH7.4，37℃） 25 mmol/L NaHCO3 120 mmol/L KCl 1 mmol/L KH2PO4 10 mmol/L MgCl2 20 mmol/L HEPES 10 mmol/L 葡萄糖 過濾滅菌，4℃ 保存可達 1 個月。 3. 透化緩沖液（pH7.4，37℃ ) 120 mmoI/L KCl 25 mmol/L NaHCO3 5 mmol/L HEPES 10 mmol/L MgCl2 1 mmol/L KH2PO4 1 mmol/L EDTA 30 μmol/L CaCl2 該緩沖液含有 100 nmol/L 游離鈣離了。過濾滅菌，4℃ 保存幾個月。 4. 標準裂解緩沖液（pH 7.4，37℃) 50 mmol/L HEPES 100 mmol/L NaCl 2 mmoI/L EDTA 2 mmol/L EGTA 50 mmol/L NaF 10 mmol/L β-磷酸甘油 1 mmol/L Na3VO4 1% NP-40 或 Triton X-100 4℃ 保存可達 6 個月。 5. 2X 裂解緩沖液（pH 7.4，4℃） 100 mmol/L HEPES 200 mmol/L NaCl 40 mmol/L EDTA 4 mmol/L EGTA 100 mmol/L NaF 20 mmol/L β-磷酸甘油 2 mmol/L Na3VO4 2% NP-40 或 Triton X-100 為了螯合激酶反應中過剩的鎂，該緩沖液含 10X EDTA。4℃ 保存可達 6 個月。 6. 2X SDS-PAGE 加樣緩沖液 0.125 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8) 室溫 4ml 10% SDS (w/v) 4ml 甘油 1ml β-巰基乙醇 0.4ml 水 0.6ml 溴酚藍 20mg 7. 雙向-PAGE 裂解緩沖液 20 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0) 0.3% SDS (w/v) 1% β-巰基乙醇（v/v) 8. 雙向-PAGE 加樣緩沖液 尿素 6g NP-40 4ml 40% 在所需 pH 范圍內的兩性電解質 0.5ml DIT 0.154g 水 1.12ml 分成小等份 -70℃ 保存可達 1 個月。 |