透明質酸的生產工藝研究

透明質酸（HA）的生產工藝主要分為二大類,以動物組織為原料的提取法和細菌發酵法。透明質酸在動物組織中的分布較為廣泛，幾乎所有的動物組織中均含有透明質酸，只是含量不同。已從下列組織中分離出了透明質酸：結締組織、臍帶、皮膚、人血清、雞冠、關節滑液、腦、軟骨、眼玻璃體、人尿、雞胚、兔卵細胞、動脈和靜脈等，但考慮到原料透明質酸含量的高低、數量的多少和易于取得的程度等成本因素，能夠用于生產的原料主要為雞冠、人臍帶和動物眼球。細菌發酵法是利用某些種屬的鏈球菌，在生長繁殖過程中，向胞外分泌以透明質酸為主要成分的莢膜。細菌發酵法與動物組織提法相比，具有生產規模不受動物原料限制，發酵液中透明質酸以游離狀態存在,易于分離純化，成本低，易于形成規模化工業生產，無動物來源的致病病毒污染的危險等優點。透明質酸無種屬差異，不同動物組織提取的及不同菌種發酵生產的透明質酸，在化學本質和分子結構上是一致的，只是相對分子質量（Ｍr）有差別。

一、以雄雞冠(roostercomb)為原料的生產工藝[1~4]

（一）工藝路線

（二）工藝過程

1．提取凍雞冠解凍后，用絞肉機絞碎，加適量水用膠體磨磨成糊狀，按每1kg雞冠加水8L，加氯化鈉80g，攪拌加熱至90℃，保溫10min，冷卻至50℃，用1mol/L氫氧化鈉液調pH8.5~9.0,加入適量胰酶,45~50℃保溫酶解5~7h，酶解過程中維持pH8.5~9.0。

2．過濾將酶解提取液用濾布加硅藻土加壓過濾，得澄清濾液。

3.乙醇沉淀和粗品干燥取濾液,調pH6.0~6.5,將濾液加到3倍體積的95%乙醇中,反復傾倒3次,待纖維狀沉淀充分上浮后,取出沉淀,用適量乙醇脫水3~5次,放入有五氧化二磷的真空干燥器內干燥,得透明質酸中間品。

4．氯仿處理將透明質酸中間品溶于0.1mol/L氯化鈉溶液中,溶解濃度為0.3%,溶解過程中加少量氯仿防腐。溶解后，調pH4.5~5.0,加入等體積的氯仿攪拌處理2次,靜置分出水相。

5．酶解將水相用稀氫氧化鈉溶液調pH7.5,加入適量鏈霉蛋白酶,37℃酶解24h。

6．絡合沉淀酶解結束后，向酶解液中加入同體積的1%氯化十六烷基吡啶（CPC）溶液，靜置，收集HA-CPC絡合沉淀。

7．解離將HA-CPC絡合沉淀加入0.4mol/L氯化鈉溶液中,攪拌解離5~10h。

8．過濾解離液先用硅藻土過濾至清,再用0.2μm微孔濾膜精濾。

9．純沉淀、真空干燥將濾液加至3倍體積的95%乙醇中，反復傾倒3次，取出纖維狀HA沉淀，脫水，五氧化二磷真空干燥，得HA精品。

（三）工藝說明與討論

1．對原料的預處理，雞冠應洗凈后冷凍儲藏。也可用丙酮脫水處理或儲存，這樣可除去大部分脂肪等雜質，以利于后面的分離純化，但成本加大。

2．雞冠絞碎后用膠體磨處理時，注意不要磨得太細，以減少機械剪切力對透明質酸的降解。磨成糊狀后，可先用水提取，過濾除去雞冠殘渣得提取液，然后進行酶解除蛋白質；也可將水提取和蛋白酶水解同時進行。后者的提取效率高，幾乎達到完全提取，但提取液中的雜質含量也較高。提取時，可在水中加入1%的氯化鈉。加熱至90℃可對原料有一定滅菌作用，并使蛋白質熱變性，易被蛋白酶水解。所用的蛋白水解酶為胰酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶等，不可用胃蛋白酶，因胃蛋白酶的最適pH值太低，易導致透明質酸的酸水解。公雞冠中的透明質酸以與蛋白質結合狀態存在，酶解的另一重要作用是切斷透明質酸與蛋白質分子的結合。提取和酶解時，應注意防腐。

3．透明質酸的提取液粘度較大，過濾速度較慢，可采用先粗濾后精濾，并加紙漿、硅藻土或活性炭助濾。

4．醇沉淀是分離提純透明質酸、肝素、硫酸軟骨素等粘多糖最常用的方法之一，在制備過程中，可多次重復使用，類似于重結晶的作用，每次醇沉淀操作，都使透明質酸的純度有所提高。不同最終濃度的乙醇沉淀操作還可對不同Ｍr的透明質酸進行分級分離，在較低乙醇濃度下，低Ｍr的透明質酸不易被沉淀出來，Ｍr越高，越容易被沉淀。在從水溶液中用甲醇或乙醇沉淀透明質酸或其它粘多糖時，必須有鹽的存在，一般為1%左右的氯化鈉。沉淀形態有纖維狀和無定型粉末狀兩種形態,纖維狀透明質酸容易制備,形態疏松,易于脫水和真空干燥,缺點是使用時，溶解速度慢，若在常溫下溶解成1%的水溶液，需要3~7d。制備無定型粉末狀沉淀，需控制料液的鹽濃度、料液和乙醇的混合速度及攪拌速度等諸多因素，工藝較復雜，但粉末狀透明質酸溶解速度快，使用方便。

5．第一次乙醇沉淀、脫水、真空干燥所得透明質酸產品，可作為化妝品用保濕劑（參見第十章）。

6．上述產品透明質酸進行進一步精制時，可以使用干燥的產品，也可使用乙醇沉淀后未干燥的產品，這樣可以縮短生產周期。

7．氯仿可使蛋白變性沉淀，利用此作用可除去一部分蛋白質雜質。氯仿處理的另一個重要的作用，是除去致炎物質。如細菌內毒素是一種脂多糖（lipopolysaccharide），其分子兼具脂溶性和水溶性，在進行氯仿處理時，聚集在氯仿和水的界面，利用這一性質可除去細菌內毒素。另外，加快攪拌速度，可提高氯仿在水中的分散度，極大地擴大氯仿和水的界面面積，提高去除細菌內毒素等致炎物質的效率。可反復多次進行氯仿處理。

8．在精制過程中，再一次使用蛋白水解酶進行酶解除蛋白質時。應選用活性較高的酶，因為酶本身是一種蛋白質，在保證酶的總活性單位的前提下，酶的總重量越少越好，這樣可減少產品中的蛋白質雜質。

9．CPC絡合沉淀與解離步驟是分離提純酸性粘多糖（透明質酸、肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素等）常用的方法之一，特點是純化效率高、回收率高，可以從很低濃度的溶液中將透明質酸或其它酸性粘多糖沉淀出來。原理是，CPC為季銨鹽，在水溶液中帶正電荷；透明質酸或其它酸性粘多糖，在水溶液中帶負電荷；在低鹽濃度下，透明質酸與CPC絡合沉淀，在高鹽濃度下，HA-CPC絡合物解離溶解。利用這一性質，可除去不能與CPC絡合并沉淀的雜質。透明質酸與其它酸性粘多糖聚陰離子的電荷密度不同，與CPC絡合生成沉淀時鹽濃度可以不同，絡合沉淀物解離所需的最低鹽濃度也不同。使用CPC絡合沉淀法，可實現透明質酸與肝素、硫酸軟骨素等酸性粘多糖的分離。此原理與離子交換法有類似之處。除CPC外，也可使用溴化十六烷基吡啶（CPB），十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等其它長鏈季銨鹽。

10．透明質酸在干燥之前要充分脫水，否則有機溶劑揮發后，殘存的水分過多，會導致被干燥的產品粘結，不易于干燥，干燥時間延長，干燥后產品變硬、變黃。脫水所用的溶劑為95%乙醇、無水乙醇、丙酮和甲醇，丙酮的沸點低，揮發性高，用丙酮脫水易于干燥，但干燥后的產品帶有特殊氣味。干燥的產品量較少時，可采用靜止狀態下，加五氧化二磷進行常溫真空干燥；產品量較多時，可采用動態的真空干燥，溫度控制在50~65℃，不用五氧化二磷。

二、以人臍帶（humanumbilicalcord）為原料的生產工藝[3,5,6]

（一）工藝路線

（二）工藝過程

1．提取丙酮脫水臍帶在提取前應通風揮發干丙酮，剪碎，加入蒸餾水中浸泡24h，用高速組織搗碎機打成細小碎塊。用蒸餾水反復提取4次，第一次加水量為脫水臍帶10倍，之后三次適量遞減。合并提取液過濾得濾液。

2．氯仿處理濾液中加入10%量的氯化鈉，攪拌使溶解。用稀鹽酸調pH5.0,加入等體積的氯仿攪拌處理，靜置，待分層后分出水相。同樣再加氯仿處理一次，分出水相。

3．酶解用稀氫氧化鈉調pH7.5,按水相體積加入0.4%量的鏈霉蛋白酶,置37℃保溫酶解24h。

4．氯仿處理再用氯仿處理2~3次，分出水相。

5．乙醇沉淀加入3倍體積的95%乙醇沉淀出透明質酸。取出沉淀，重新溶解于0.1mol/L的氯化鈉溶液中,再次用3倍體積95%乙醇沉淀。

6．脫水干燥分別用95%乙醇、丙酮脫水，五氧化二磷真空干燥得透明質酸精品。

（三）工藝說明與討論

1．對原料預處理，新生兒臍帶剪下后，應盡量擠出里面血管中存留的血液，再放入丙酮中脫水保存。若在提取前發現脫水臍帶血管中殘存較多血凝快，應將血管剝離，以減少提取和純化過程中的血色素污染。否則，產品帶有顏色。

2．本工藝盡量采用溫和條件，避免可能使透明質酸大分子降解的處理，如加熱、強酸、強堿等。

3．實驗發現，在高鹽濃度下，有機溶劑可使大部分蛋白質變性，或被鹽析沉淀出，或在乙醇沉淀后不再溶于水，這樣可使提取液得到明顯的純化。

4．本工藝未使用氯化十六烷基吡啶（CPC）絡合沉淀法進行純化，所得產品純度較低，可能混有其它多糖，蛋白質雜質含量也較高(0.6%~0.8%)，但由于所用的原料為人臍帶，所得透明質酸精品作為眼科手術用粘彈輔助劑時,引起抗原反應的可能性較小。

三、以動物眼玻璃體為原料的制備工藝[3,7,8]

（一）工藝路線

（二）工藝過程

1．提取將冷凍的牛、豬或羊眼球解凍，剝出玻璃體，融化后離心，分出上清，加入1.5倍體積的丙酮沉淀。8h后離心，所得沉淀加入到1mol/L氯化鈉溶液中，攪拌提取4h，離心。

2．除蛋白質上清液在低溫下加入冷的5%三氯乙酸，攪勻，立即離心分出上清液，用5mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至中性。

3．粗品沉淀將中性上清液倒入2倍體積95%乙醇中，分出沉淀。

4．溶解、吸附除雜質將沉淀溶于0.1mol/L氯化鈉溶液中，加入處理好的漂白土攪拌吸附2h，離心收集上清液。

5．絡合沉淀向上清夜內加入等體積的1%CPB溶液，得HA-CPB沉淀。放置12h后離心，收集沉淀。

6．解離沉淀洗滌后于0.4mol/L氯化鈉溶液中解離4h，抽濾。

7．沉淀、干燥：將濾液倒入3倍體積95%乙醇中，分出沉淀。沉淀經乙醇、丙酮脫水，放于有五氧化二磷的真空干燥器內干燥，得玻璃酸鈉精品。

（三）工藝說明與討論

1．以動物眼玻璃體為原料制得的透明質酸，其質量較以雄雞冠和人臍帶為原料者差，相對分子質量Mr較小，一般不適于作注射劑使用。

2．吸附除雜質步驟，尚可選用類似吸附劑。天然礦物質吸附劑常因生產廠或同一廠批次不同在吸附性能上有差異，其預處理方法也很重要，要根據實際情況實驗研究來確定具體操作方法。3．CPB與CPC的性能基本相同，兩者在透明質酸的生產中可相互代用。

四、細菌發酵法生產工藝

（一）工藝路線[10~12]

（二）工藝過程

1）搖瓶種子液的培養取斜面菌種，接種于裝有滅菌培養液400ml的1L錐形瓶中，37℃培養12~16h，光鏡觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中。培養液配方：蛋白胨10g、牛肉浸膏5g、酵母膏5g、葡萄糖5g、磷酸氫二鉀2g、硫酸鎂0.3g，加水溶解至1L，115℃滅菌30min。

2）種子罐種子液的培養按搖瓶種子液的配方配制培養液100L，加入種子罐中，通蒸汽加熱，115℃滅菌30min。冷卻至37℃，用火焰接種法，將搖瓶種子液接種于種子罐中，通氣量50L/min，攪拌120rpm，37℃培養12~16h。光鏡觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可待接種于發酵罐中。

3）發酵按搖瓶種子液配方，將葡萄糖含量提高到5%，配制發酵培養液1000L，加入1.4m3發酵罐中,通入蒸汽加熱,115℃滅菌30min。冷卻至37℃后，將種子罐中的種子液通過移種管道移至發酵罐中，維持通氣量500~600L/min，攪拌轉速120rpm，37℃發酵40~46h。在發酵過程中，發酵液的pH值不斷下降，加5mol/L氫氧化鈉溶液，調pH6.5~7.0。發酵后期，葡萄糖濃度下降至0.5%以下,pH值下降很慢或不再下降時,即為發酵終點。

4）下游分離純化發酵結束,用三氯乙酸調pH4.0~4.5,板框過濾除菌體,濾液用稀氫氧化鈉調pH6.0~6.5,加三倍體積95%乙醇,沉淀出透明質酸。沉淀用發酵體積的0.1mol/L氯化鈉水溶液溶解，加入0.5%的活性炭，攪拌吸附1h。過濾，濾液在攪拌下,加入過量的1%CPC水溶液與濾液中的透明質酸發生絡合沉淀,靜置使沉淀下沉,虹吸出母液,加入0.1mol/L氯化鈉液洗滌沉淀兩次。沉淀于發酵體積的0.4mol/L氯化鈉液中攪拌解離過夜,過濾,濾液加三倍體積乙醇沉淀,沉淀用乙醇和丙酮脫水,用旋轉式真空干燥器進行干燥,得透明質酸鈉。

（三）工藝說明與討論

1.早在1937年，Kendall等[12]就發現鏈球菌可產生透明質酸，許多人對此進行了研究。鏈球菌屬的多種細菌具有莢膜(見圖3-1和圖3-2)，這種莢膜的主要成分就是透明質酸。鏈球菌在生長過程中，莢膜的產生有幾種不同的情況，有的菌株在整個生長期都有莢膜，有的在對數生長期的前段產生，后段消失，或穩定期消失，有的根本不產生莢膜。進一步的研究發現這與菌種是否產生透明質酸酶有密切關系，事實上目前一部分商品透明質酸酶就是用鏈球菌發酵制得的，莢膜的消失是由于被酶解了。MacLennan[13]根據是否產生透明質酸和透明質酸酶，將具有莢膜的鏈球菌C組分為三類：

1）只產生透明質酸，不產生透明質酸酶；

2）透明質酸和透明質酸酶都產生；

3）只產生透明質酸酶，不產生透明質酸。

因此，透明質酸酶的產生對透明質酸的發酵非常不利，在菌種的篩選時，要注意觀察判斷菌種是否同時產生透明質酸酶。可產生透明質酸的鏈球菌多為A組和C組,A組中主要有釀膿鏈球菌等,由于致病性較強,較少用作菌種進行大規模發酵；C組致病性較弱，多采用此類菌，主要有獸疫鏈球菌、馬鏈球菌和類馬鏈球菌等。發酵生產透明質酸所用的菌種,一般是將產生透明質酸的鏈球菌進行誘變處理得到,誘變方法有紫外線照射,化學誘變劑處理等。Nimrod[11]和細谷[14]等，分別在專利中介紹了用N-甲基-亞硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine,NTG）,對獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)進行誘變處理的方法,經過幾步誘變處理,篩選出莢膜大、透明質酸產率高，無透明質酸酶和溶血素的變異菌株。實驗證明，經誘變處理的菌種的發酵產率高達6~7g/L，而且相對分子質量也有較大提高。除鏈球菌外,還有Pasteurellamultocida可產生透明質酸[15]。

圖3-1鏈球菌莢膜示意圖早期對鏈球菌莢膜透明質酸的研究，主要是為了探索鏈球菌的莢膜組成和其作用[16~20]及實驗室少量制備[21,22]等。研究發現，莢膜對鏈球菌有重要的保護作用。由于透明質酸為動物體內廣泛存在的物

圖3-2鏈球菌及其莢膜光鏡照片

圖3-3透明質酸在鏈球菌中的合成路線ATP：腺苷三磷酸，ADP：腺苷二磷酸，UTP：尿苷三磷酸，UDP：尿苷二磷酸，NAD：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，CoA：輔酶A，Ac：乙酰基，P：磷酸，PP：焦磷酸

圖3-4透明質酸的合成示意圖

1--6為合成HA的順序質，無任何抗原性，以透明質酸和水為主要成分組成的莢膜，覆蓋在菌體表面，使動物機體的免疫系統無法識別，免受攻擊。以工業化生產為目的的發酵透明質酸研究始于80年代初期[23],在借鑒前人對某些鏈球菌產生透明質酸莢膜這一重要發現,利用現代液體深層發酵技術和設備,對菌種、培養基、各種發酵參數條件進行了優化，并對細菌生物合成透明質酸的代謝過程進行了深入研究，闡明了透明質酸在菌體內的合成路線（見圖3-3，圖3-4），使發酵產率和透明質酸的Ｍr有了大幅度的提高，發酵法已成為透明質酸生產的主流工藝。

2.鏈球菌的營養需求較高,通常需含血清[12,16,24]、小牛肉浸出液（vealinfusionbroth）[22]、腦心浸出液（brainheartinfusion）[18]等培養基，菌體才能較好地生長，但這類營養物質價格昂貴，作為一般試驗研究可以，大規模生產中用其作為培養基，成本太高。所以在選擇菌種時，要考慮其營養需求及所用培養基的成本問題。發酵生產透明質酸所用的培養基，氮源為蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母膏或浸出粉、牛肉浸膏、大豆蛋白水解液、尿素、無機銨鹽等。其中酵母膏最常用，除了作為氮源外，還含有多種維生素和生長因子，有些是鏈球菌生長所必需的。在發酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸[25]，可以提高透明質酸的產率。碳源主要是各種單糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖。其他還有磷酸鹽、硫酸鹽，鉀、鈉、鈣、鎂等無機鹽，鐵、錳、銅、鋅等微量元素。

3.鏈球菌屬于兼性厭氧菌,有氧和無氧條件下，都可以生長。在透明質酸的發酵工藝中，大多數采用有氧發酵，也有的采用厭氧發酵[26,27]。根據透明質酸在鏈球菌內的生物合成路線（見圖3-3），有氧發酵的葡萄糖能量代謝可產生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是生成透明質酸的兩個活化前提物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖，所必需的物質。因此從代謝調控的角度來說，有氧發酵有利于透明質酸的合成。Swann等[28]報道,發酵液中氧含量高,可使葡萄糖的代謝轉向菌體增殖,而透明質酸的合成減少;氧含量低時,菌體增殖減少,透明質酸的合成增加。除了合成透明質酸外，還有小分子有機酸，氧含量高時，產生較多的醋酸，反之，產生較多的乳酸。Nimrod等[29]用獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920的一個變異菌株進行發酵,在厭氧條件下,透明質酸的產率為2g/L;在通氣條件下,為4~6g/L。一般通氣量為1~2vvm（pervolumeofmediumperminute）。在發酵過程中通常保持一個適當的溶氧量，而在不同階段采用不同的溶氧量，是提高發酵產率的有效手段之一。通過增加通氣量和提高攪拌轉速可提高發酵液的溶氧,但轉速過快可導致透明質酸的機械降解。在發酵罐上最好加一個溶氧傳感器，可以在發酵過程中在線檢測和控制發酵液的溶氧，并對整個發酵過程的溶氧進行自動紀錄。

4．在透明質酸的發酵過程中，pH值是一個重要的因素，一般控制在6.0~8.5范圍內,最好在7.0左右,低于6.0或高于8.5,會影響菌體生長,降低透明質酸的產率。pH值低于5.0或高于9.0,菌體生長和代謝很慢或停止。發酵過程中，菌體產生的醋酸和乳酸等小分子有機酸的總量要大于透明質酸，因此可使發酵液的pH值以0.01~0.15/min的速度降低，需用氫氧化鈉或碳酸鈉溶液進行中和，以維持適當的pH值。用高濃度的氫氧化鈉溶液，無需高溫滅菌可直接加入發酵液中。在發酵罐上安裝一個在線的pH自動檢測控制裝置是很有必要的。

5．在搖瓶和種子罐培養階段，溫度一般控制在37℃。發酵溫度一般為37℃，也有的采用35℃或33℃等較低的溫度，或在不同的階段采用不同的溫度。在種子培養階段和發酵的初期，37℃培養可使菌體較快的生長繁殖，發酵中期和后期可適當降低溫度，據報道可使葡萄糖的代謝方向由合成菌體細胞壁轉向合成透明質酸，提高透明質酸的產率和Ｍr。

6．藥用級透明質酸的Ｍr要求較高，發酵法生產的透明質酸的平均Ｍr為1~4MDa，人們試圖通過葡萄糖的代謝調控，來提高透明質酸的Ｍr。Kitchen等[30]發現從成纖維細胞（fibroblastcells）分離出的透明質酸合成酶的半衰期僅有2~4h，大約相當于一條透明質酸分子鏈的合成時間，于是推斷：一個透明質酸分子的Ｍr或鏈長度，取決于合成它的合成酶在其生命期內可聚合前提物分子（UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖）的數量。根據這一理論，菌體過多的表達透明質酸合成酶，酶分子之間會競爭同一前提物資源，導致透明質酸Ｍr的降低。以上分析推斷，為提高透明質酸的Ｍr可考慮采用的幾個策略,這幾個方面的組合，是提高透明質酸Ｍr的關鍵。1）延長透明質酸合成酶的生命期2）降低生物量的合成，以減輕前提物資源的競爭3）增加透明質酸合成的前提物資源4）提高細胞的能源效率（energyefficiency研究發現,許多發酵參數可顯著影響透明質酸的Ｍr。具體地說，低發酵溫度（28℃），通氣和高初始濃度的葡萄糖（40g/L）可產生高Ｍr的透明質酸（菌種：S.zooepidemicus）,而發酵液pH值和攪拌速度對透明質酸Ｍr基本無影響。

7.菌體在發酵過程中，不斷向胞外分泌透明質酸，在攪拌等作用下，擴散溶解到發酵液中。隨著發酵液中透明質酸的積累，發酵液的粘度逐漸增高,在發酵進程中每隔一定時間測定發酵液的粘度可直觀地反映出透明質酸的發酵情況，粘度越高，說明發酵液中透明質酸的含量高、Ｍr大。

8.種子培養和發酵過程中菌體密度的測定是以光吸收度（660nm）或單位體積發酵液中菌體的濕重來表示，每隔一定時間測定菌體密度可反映出菌體的生長繁殖情況。值得注意的是，對于同一種菌種，在不同的發酵條件下，菌體密度高，但透明質酸產率不一定高，這說明細菌在某種條件下，主要利用葡萄糖進行菌體增殖，作為次級代謝產物的透明質酸的合成減少了，它不是構建菌體所必需的物質。因此，為了提高透明質酸的產率，需要對發酵參數條件和發酵液的配方進行優化。

9．關于下游分離純化，發酵液中的透明質酸在菌體外的溶液中游離存在，提取時無需破碎菌體，與從動物組織提取相比，易于分離純化。首先要殺滅和除去發酵液中的菌體，通常加入殺菌劑或75~80℃加熱進行滅菌。最常用的殺菌劑為三氯乙酸和陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS），兩者可配合使用，SDS的另一作用是使蛋白變性和促進透明質酸與菌體的分離。透明質酸的含量較高時，發酵液的粘度很高，直接過濾或離心除菌體非常困難，需要先進行稀釋。除菌體后的清液，經乙醇沉淀、氯仿處理、CPC沉淀、離子交換、超濾等方法進行分離純化，最后用有機溶劑沉淀、真空干燥或冷凍干燥制得透明質酸精品。這些方法與前述從動物組織提取時的分離純化方法基本一致。表3-1動物組織提取法和細菌發酵法生產透明質酸的比較

10．發酵法生產透明質酸具有產量不受動物原料資源限制，成本低，分離純化工藝簡捷，易于規模化生產等優點（見表3-1），是透明質酸的生產的發展方向，應從提高產率、提高產品Ｍr和分離純化技術方面進一步深入研究。