通過序列雜交和條形碼進行單細胞原位分析

　　現代系統生物學有兩種革新技術：基因組學和單細胞生物學，前者具備同時監測生物體中所有基因和蛋白質的能力，后者則可以在自然微環境中跟蹤單細胞的一些特定基因。

　　兩種技術都很強大，但具有互補的局限性：基因組學平均了一個細胞群的異質性和空間復雜性，而單細胞技術一次只能探測幾個基因。因此，將基因組學與單細胞結合的生物學方法是下一階段的主要挑戰。生物和生物工程教授Long Cai致力于開發合成基因組學與單細胞的革新方法。

　　通過序列雜交和條形碼進行單細胞原位分析

　　過去幾年，Cai教授實驗室采用FISH的原位“測序”來分析單細胞的基因表達。為了檢測每一個mRNA，他們的序貫FISH（seqFISH）策略在概念上類似于用FISH探針對單個細胞中的轉錄序列進行測序，用FISH探針進行序列雜交，對mRNA進行編碼。在一輪雜交過程中，每個轉錄物都被一組標有單一熒光團的FISH探針作為目標，然后對樣品進行成像，利用酶消化去除FISH探針。在隨后的一輪采用相同的FISH探針雜交，但使用不同的染料標記。由于轉錄物是固定在細胞中的，多輪雜交過程下來，對應單個mRNAs的熒光點仍保持在原位，并且可以對齊以讀取顏色序列。因此，每種mRNA都被分配到了一個獨特的條形碼，通過計算相應條形碼的數量就可以確定給定單元中每個轉錄本的數量。

　　seqFISH的可用條形碼數量理論上可以覆蓋整個轉錄組（6輪雜交），但需要超分辨率顯微鏡來解析細胞中的所有轉錄情況。Cai課題組最近發表在《Nature》雜志上的文章介紹了改進版seqFISH+，其僅需利用序列雜交和普通共聚焦顯微鏡即可獲得單個細胞內不少于10,000個基因的多路復用和超高分辨率成像。

　　seqFISH+的關鍵在于擴展的條形碼庫。seqFISH平臺使用四種或五種顏色染料，升級版技術則擁有更龐大的“偽顏色”調色板（圖1）。通過使用60個偽顏色通道，研究人員有效地將mRNA分子稀釋成60個單獨的圖像，并在重組圖像以重建超分辨率圖像之前使每個mRNA點定位于衍射極限以下。

　　60種偽顏色被分為3個熒光通道（Alexa Fluor 488、Cy3b和 Alexa Fluor 647），并且只在每個通道內生成條形碼，以避免通道間色差。每個通道可包含8000個被打上條碼的基因，當用偽顏色成像四次時（其中一輪用于糾錯），理論上可獲得24,000個基因的信息，與seqFISH相比，成像時間縮短了8倍。

　　最初，研究團隊在純凈的NIH/3T3成纖維細胞中檢測seqFISH+的實際效率。隨機選取10,000個基因（排除高豐度的看家基因），結果每個細胞大約獲得了35,492±12,222個轉錄本，其中60個基因的單分子熒光原位雜交（smFISH）結果顯示，其靈敏度比單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）更高。

　　研究人員進一步使用相同的10,000個基因探針觀察了小鼠腦室下區（SVZ）皮層和嗅球獨立組織切片，總共收集了2,963個細胞中10,000個基因的轉錄圖譜（圖2）。

　　為了節省時間，本文只觀察了一個光學平面（0.75μm厚），如果從3D角度觀察，每個細胞的可檢出轉錄本將是文中的5-8倍。在無監督聚類分析處理下，seqFISH+細胞簇清晰地呈現出層狀結構，與scRNA-seq數據集強烈相關。

　　在seqFISH+的幫助下，人們有能力以細胞類型為單位直接探索腦內上萬mRNAs的亞細胞定位模式。在本文中，科學家們定量了SVZ和嗅球內不同細胞類型的空間組織結構。此外，還分析了富含相鄰細胞信息的配體-受體對，在過去，研究人員無法從分離細胞中獲得這些信息。事實上，這些潛在的細胞-細胞相互作用基于mRNA而非蛋白質。令人意外的是，特定細胞類型的基因表達模式高度依賴于局部組織背景。

　　這些實驗結果表明，seqFISH+能夠很好地繪制組織中的轉錄組，克服了光學擁擠，展現了seqFISH+在組織中生成空間單細胞圖譜的強大應用潛力。與現有方法相比，seqFISH+在每個細胞中檢出的mRNAs數目和RNA條形碼總數擴大了10倍以上，它讓人們得以使用普通共聚焦顯微鏡進行超分辨成像，并有能力推廣至染色體和蛋白質成像。

　　“它的高通量基因組覆蓋率和空間分辨率是闡明細胞間信號相互作用，理解發育過程和細胞命運決定的重要武器，最后，還有助于我們發現疾病樣本中特定細胞類型的靶點，為精確的空間基因組學和單細胞診斷打下堅實基礎，”文章作者總結道。