通過細胞計數對疾病模型小鼠進行免疫監測
摘要
生物樣本往往是非單一細胞的混合物，如原代分離的細胞樣本和許多培養的細胞樣本都是由不同種類或不同功能的細胞組成。而對于樣本中不同細胞亞群的區分和定量恰恰是很多研究中的關鍵一環。這些混合在一起的不同細胞通常是使用流式細胞儀和熒光標記的細胞類型特異性抗體來進行區分的。值得注意的是，許多細胞的類型和生理狀態的鑒定不僅僅可以通過蛋白表達的變化來鑒別，也可以根據細胞大小的變化來區分。
對疾病模型小鼠的脾臟細胞進行檢測，可以監測小鼠體內的免疫系統的變化，但脾臟細胞樣本是比較復雜的多種細胞的混合物。本文以埃里希體病小鼠模型作為例子，對其脾臟細胞進行了流式細胞分析與Scepter細胞計數儀分析，并對比了檢測結果，結果表明通過簡化的細胞計數方法也能對疾病模型小鼠進行免疫監測。
前言
人類單核細胞埃里希體病（Human Monocytotropic Ehrlichiosis，HME）是一種由蜱傳播的急性病，由侵入單核噬菌細胞的病原菌Ehrlichia chaffeensis引起。HME初期出現像感冒一樣的癥狀，但到后來可以發展成為有生命危險的中毒性休克癥狀，同時伴有貧血、血小板減少癥和多種器官衰竭。HME不會導致病人體內很大的帶菌量但卻會出現廣泛性的炎癥，這種現象表明HME導致的死亡是由不受控制的免疫病理引發的結果1,2。本篇文獻使用了感染Ehrlichia muris菌的C57BL/6 小鼠作為HME小鼠模型，并研究此小鼠模型的免疫反應尤其是脾臟細胞亞群的變化動態。
實驗材料和方法
小鼠感染Ehrlichia muris菌
6-8周大的C57BL/6小鼠通過腹膜腔感染Ehrlichia muris菌。感染后第30天收集小鼠脾臟。脾臟樣本使用GentleMACSTM 組織處理器形成單細胞懸液。
使用Scepter細胞計數儀檢測脾臟細胞的分布
細胞稀釋至合適的濃度（~1 – 2 x 105 細胞/mL）并上樣到裝有40μm sensor的Scepter細胞計數儀。未感染的小鼠脾臟細胞用于設定設門，以區分血紅細胞。實驗使用了3個未感染的小鼠的脾臟細胞樣本和3個感染Ehrlichia muris菌的小鼠脾臟細胞樣本。實驗數據使用Scepter Software Pro軟件進行分析。
使用流式細胞儀檢測脾臟細胞的分布
脾臟細胞用檢測細胞存活的熒光染料（Near IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain kit）在PBS緩沖液中避光室溫孵育10分鐘。細胞用Fc BlockTM和稀釋在流式緩沖液（PBS + 2% FBS + 0.09% 疊氮鈉）中的兔子、大鼠和小鼠IgG進行清洗和封閉。然后細胞用熒光標記的細胞表面標志物抗體B220（B細胞）以及Ter119（紅細胞）進行孵育及流式細胞分析。
結果
小鼠脾臟細胞的單細胞懸液使用多色流式細胞分析（圖1）。基于細胞大小的正向散射光區分確認了所有樣本中均存在2個顯著的細胞群體。使用對B細胞特異性的B220抗體和對紅細胞特異性的Ter-119抗體進行染色表明，紅細胞僅存在于較小細胞的亞群中，而含有較大細胞的亞群基本上由淋巴細胞組成。
流式細胞檢測的直方圖結果顯示總細胞中一共有3個明顯的亞群，包括碎片、淋巴細胞（較大的細胞）和紅細胞（較小的細胞）。對Ehrlichia菌感染的小鼠脾細胞和陰性對照小鼠的脾細胞進行對比分析，結果顯示在相對的細胞分布中出現了整體的遷移。具體來說，感染樣本的紅細胞亞群相對于白細胞亞群的比例上升了（圖2B及 表格1）。與此結果相比較，Scepter細胞計數儀的直方圖結果能夠檢測到2個峰；相當于細胞碎片的第3個峰由于顆粒太小而低于檢測的底線。雖然如此，但Scepter對脾臟細胞的總量以及對不同亞群比例的檢測結果與流式細胞儀的檢測結果非常一致。
對于感染小鼠的脾臟細胞濃度的整體評估，結果表明細胞亞群分布的變化是由于脾臟的紅細胞亞群增加了，而淋巴細胞的值保持恒定（表格2）。這些發現與以前發表的文獻結果一致3。
結論
測評免疫系統對病毒、細菌、細胞和環境刺激的反應是對病原分析和毒性分析的一種重要的工具。用于鑒別細胞的活化狀態和檢測非單一細胞樣本的細胞亞群的相對比例的簡化方法，對于加速這些領域的科研是非常有用的。本篇文章中的數據顯示，Guava easyCyte 流式細胞儀平臺與Scepter細胞計數儀能從新鮮分離的原代細胞與培養的細胞樣本中檢測出這些變化。兩種方法相比，流式分析系統是更復雜的定量工具，Scepter則是一個更便捷的工具，Scepter在細胞培養安全柜內就可使用并能很好地揭示不同刺激后細胞的反應，而且分析結果與現存的方法有很好的一致性。
Scepter細胞計數儀結合了手持與自動計數的方便性以及庫爾特原理計數的準確性。Scepter儀器能確保重復性很好的細胞計數，提高了實驗設立過程和下游細胞分析實驗的數據質量，為實驗結果良好的重復性打下基礎。
圖1.細胞表面標志物鑒定小鼠脾臟細胞的亞群。正向散射光對比側向散射光的圖譜揭示存在著兩個主要的脾細胞亞群。包含較大細胞的組分（圖A）主要由淋巴細胞（B、NK、T）組成。而包含較小細胞的組分（圖B）主要由紅細胞組成（Ter119+）。
圖2.根據細胞大小對小鼠脾細胞分類。未處理的樣本和被Ehrlichia感染的樣本使用了流式細胞儀進行分析（A, B）以及Scepter細胞計數儀進行分析（C）。使用流式細胞儀可見3個顯著的峰，分別對應于淋巴細胞，紅細胞和細胞碎片。使用Scepter細胞計數儀可見2個顯著的峰，對應于淋巴細胞和紅細胞。細胞碎片的峰內顆粒大小低于40μm sensor的檢測下限。
表格1. 淋巴細胞和紅細胞總的比例（ 6個獨立的脾臟細胞新鮮分離樣本，其中3個對照樣本，3個感染樣本）。每個樣本均用流式細胞儀和Scepter細胞計數儀進行分析。
表格2. 所有6個樣本的淋巴細胞和紅細胞的總濃度。
參考文獻：
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