通過重疊延伸和基因SOEing進行PCR突變實驗

試劑、試劑盒 無菌 H2OPCR 緩沖液限制性酶和緩沖液Taq DNA 聚合酶PCR 模板5'和 3'引物dNTP

儀器、耗材 DNA 測序裝置熱循環儀瓊脂糖凝膠電泳設備

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

無菌 H2O

2. 酶和酶緩沖液

10XPCR 緩沖液（Roche)，包含 100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/L，KCl 和 15 mml/LMgCl2(參見 32.3 注釋/評價 4，以決定恰當的 Mg2+濃度）。

限制性酶和緩沖液（參見步驟 8 和 32.3 注釋/評價 6）

Taq DNA 聚合酶（Roche)

3. 核酸和寡核苷酸

10X dNTP, 商品出售的 dNTP 溶液（AmershamBiosciences) 是 100umol/L 濃度的儲存液，可以用無菌水稀釋。

PCR 模板（參見 32.3 注釋/評價 3)

5'和 3'引物（參見 32.3 注釋/評價 2）

4. 特殊設備

DNA 測序裝置（參見 32.3 注釋/評價 6)

熱循環儀

5. 其他

瓊脂糖，分離 DNA 片段所需的瓊脂糖濃度依賴于需要分離的片段的大小。依經驗，0.8%~1% 的 SeaKem GTG 瓊脂糖（Cambrex)(用 1XTAE 配制）一般都能夠令人滿意地分離 0.25~2kb 大小的 DNA 片段。

瓊脂糖凝膠電泳設備

GENECLEANⅡ試劑盒（BIO101)

6. 載體和菌株

PCR 產物測序所需的克隆載體和菌株。

二、方法

1. 通過重疊延伸進行 PCR 突變

（1）在獨立的微量離心管中進行 PCR 反應生成產物 AB 和 CD(參見圖 32-1)。這些反應混合物能夠在室溫下混合。有關引物和模板濃度可以參見 32.3 注釋/評價 2 和 3。

（2）反應進行 30 個循環（94°C 1min,50°C 1min,72°C 2 min)。

（3）將每個反應的所有反應物進行瓊脂糖凝膠電泳。

（4）切下目標條帶（即產物 AB 和 CD)，用 GENECLEANUⅡ試劑盒回收 DNA 片段。

（5）在一個新的微量離心管中進行重疊延伸反應。

這一反應對于加入的模扳量不十分敏感。通常每種模板可以使用 10~100ng。引物 a 和 d 也可以在PCR 反應的開始就加入。

（6）參照上面的步驟 2 進行 PCR 擴增。

（7）將反應物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下目標條帶（即產物 AD)，參照步驟 4 回收 DNA片段。

（8）純化的突變產物 AD 隨后可以被適當的限制性酶所消化，然后連接到一個合適的克隆載體上進行后續的轉化和測序（參見 32.3 注釋/評價 6）。

2. 基因 SOEing

（1）在獨立的微量離心管中進行 PCR 反應，以分別產生來自基因 1 的產物 WX 和來自基因 2 的產物 YZ(圖 32-2)。關于引物和模板的濃度參見 32.3 注釋/評價 2 和 3。

（2）反應進行 30 個循環（94°C lmin,50°C lmin，72°C2 min)。

（3）將每個反應的所有反應物進行瓊脂糖凝膠電泳。

（4）切下目標條帶（即產物 WX 和 YZ), 用 GENECLEANB 試劑盒回收 DNA 片段。

（5）在一個微量離心管中進行 SOEing 反應。

（6）參照上面的步驟 2 進行 PCR 擴增。

（7）將反應物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下目標條帶（即產物 WZ), 參照步驟 4 回收 DNA 片段。

（8）純化的突變產物 WZ 隨后可以被適當的限制性酶所消化，然后連接到一個合適的克隆載體上進行后續的轉化和測序（參見 32.3 注釋/評價 6）。