| 實驗步驟 | 材料
磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L;PH7.5~8,0)
Affi-Gel 10(Bio-Rad Laboratories)
磷酸鈉（50 mmul/L），含 NaCl(1mol/L)(PBS)
乙醇胺（100 mmol/L)
操作程序
1) 用 50 mml/L 磷酸緩沖液（pH7.5~8.0) 配制 1~10 mg/ml 的蛋白質（配體) 溶液。此蛋白制備液必須不含其他氨基化合物。因此. 不應用 Tris 緩沖液或含銨鹽的緩沖液。可用的緩沖液有磷酸緩沖液、MES、MOPS 和 HEPES 等。如果蛋白制備液含有其他氨基化合物，可用 0.5mol/L 磷酸緩沖液（pH7.5~8.0) 將其透析掉。留取少量蛋白樣品，供測定偶聯效率用。
2)Affi-Gel 10 膠是以異丙醇懸液供應的。使用時必須將異丙醉去掉，以免引起配體蛋白失活。將 Affi-Gel 10 懸液傾入一燒結玻板漏斗。4℃下，用去離子水快速洗膠數次。不要讓膠干了。如膠干掉，陷入微球內部的氣泡會使某些連接位點（linking site) 失效。
3) 將洗過的 Affi-Gel10 微球加入蛋白溶液（每 0.5 ml 配體溶液約加 1 ml 微球)。室溫下在搖床上輕輕混合過夜。
4) 過濾分離微球。保留濾液。測定濾液及步驟 1 留樣的蛋白濃度，以計算偶聯效率。蛋白濃度可用幾種方法測定。如果用 OD280 測定蛋白濃度，則必須加入 0.1mol/L HCl, 使溶液 pH 降至 6.0 以下。否則，偶聯時釋出的 N-羥基琥珀酰亞胺在中性或高 pH 條件下會于 280nm 處有吸收。偶聯效率只影響膠的容量。
5) 用磷酸緩沖鹽溶液（PBS) 沖洗微球 。
6) 將微球置 100 mmol/L 乙醇胺中孵育 4 h 或過夜，以封閉剩余的反應性位點。
7) 用 FBS 沖洗微球。至此，親和介質已可使用。 展開 |
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