酪蛋白激酶分析實驗_用多肽底物

酪蛋白激酶 I 可用多肽 AspAspAspGluGluSerIleThrArgArg 進行分析，最近釀蛋白激酶 II 也已被特異性的多肽底物分析，如 ArgArgArgGluGluGluThrGluGluGlu（下劃線殘基是磷酸受體）。兩個多肽均可通過精氨酸殘基結合到 P81 磷酸纖維素膜上。第一個多肽對酪蛋白激酶 I 相對比較特異，但它的磷酸化反應動力并不理想，其 K_m 值大小在毫摩爾范圍。因此只有在此酶的純度很高時用于酪蛋白激酶 I 分析比較理想。

合成肽底物溶液有酪蛋白激酶活性的酶樣品

[γ-32P] ATP 溶液酪蛋白激酶反應緩沖液TCASDS-PAGE 樣品緩沖液

30°C 水浴P81 磷酸纖維素膜離心管離心機

1. 每個分析反應按以下比例將各反應組分加入 1.5 ml 微量離心管中：

10 μl 5 × 酪蛋白激酶反應緩沖液

5 μl 10 mmol/L用于酪蛋白激酶分析的合成肽底物溶液

5 μl [γ-³²P] ATP溶液（ATP終濃度為5 μmol/L，放射活性為5 μCi/μl）

0~30 μl 水

蓋好離心管，放入 30℃ 水浴溫育 10 min。每個反應的容積為 50 μl，加入水的量取決于加入酶樣品的量。

2. 加入 1～30 μl 有酪蛋白激酶活性的酶樣品開始反應。

3. 30°C 水浴，10 min。

4. 按不同的分析目的和方法加入適當的試劑停止反應：20 μl 預冷 10 % TCA 進行 TCA 沉淀，或 10～20 μl 預冷的 2 × SDS-PAGE 樣品緩沖液進行電泳分析。

可用 10 μl 的反應混合物點膜，使酶吸附在 P81 磷酸纖維素膜上。用那些方法中的一種繼續進行分析。

加入酶量的容積取決于樣品中酶活性的大小。在預試驗中所得的最大反應值可衡量磷酸轉移反應的程度。在反應中為了保持磷酸基與底物的線性結合關系可適當減小酶的加量。