酵母人工染色體的應用

實驗方法原理 直到 20 世紀 80 年代中期，尚無技術可用于基因組 DNA 黏性大片段的分離、擴增和分析。在此之前，如果要對某一 DNA 片段進行詳細的物理和功能研究，該 DNA 的長度應能夠裝入 λ 噬菌體顆粒或黏粒載體。

實驗材料 釀酒酵母

試劑、試劑盒 甘油

儀器、耗材 脈沖場凝膠電泳儀選擇性培養基YPD 瓊脂平板YPD 培養基試管

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液和溶液

用 YPD 培養基配制的 30% (V/V) 的甘油

2. 凝膠

脈沖場凝膠電泳儀

3. 培養基

選擇性培養基

YPD 瓊脂平板

YPD 培養基

4. 專用設備

試管（2 ml )

5. 載體和酵母菌株

攜帶重組 YAC 克隆的釀酒酵母

二、方法

1. 實驗室獲得克隆后，立即劃線接種于選擇培養基中，30℃ 培養 48 h 以獲得單個菌落。

2. 挑取 6~12 個單菌落，分別加入 10 ml YPD 培養基中。將培養物在 30℃ 劇烈振蕩 ( 300 r/min ) 培養過夜。在此期間，細菌數應達到飽和（OD600=2.0~3.0，約為 3 X 107 個細胞/ml)。

3. 分別從每一培養物中取 9 ml，提取酵母 DNA。

4. 用 PFGE 分析每一個 DNA 產物中 YAC 的大小。

5. 用 Southern 雜交或 PCR 確定 YAC DNA 中存在靶序列。

6. 如果結果滿意，即培養液中含有的 YAC 大小相同，沒有不穩定或重排的跡象，并且靶序列也存在，則可以選擇 1~2 個培養物長期保存。