酵母剪接體分析實驗

Tris HCI 溶液 EDTA TE 乙酸鈉 SDS RNA 的勻漿緩沖液 RNA 的溶解緩沖液 Tris 堿 Tris EDTA 平衡苯酚 乙醇 硅烷化溶液 TPM8 緩沖液 mRNA HEPES-KOH R 緩沖液 上樣緩沖液 去離子甲酰胺 Northern 印跡雜交液

液氮 離心機 勻漿器 旋轉真空濃縮儀 試管 離心管 玻璃板 聚四氟乙烯墊片 梳子 黃色膠帶 電泳槽 電源 平頭毛細管吸頭 濾紙

一、材料與設備

1. 從鼠組織中制備競爭性 RNA

除非另有說明，所有溶液都用無菌蒸餾水配制。

(1) DEPC 處埋水。

(2) Tris HCI 溶液：1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，0.1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )。1 mol/L Tris-HCl 配好后，高壓滅菌，室溫保存，0.1 mol/L 的 Tris-HCl 由 1 mol/L Tris-HCl 溶液加無菌水稀釋而成。

(3) 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0)。

(4) 1X TE：10 mmol/L Tris-HCI ( pH 7.6 )，1 mmoI/L EDTA。

(5) 1 mol/L MgCl₂ 及 0.1 mol/L MgCl₂ 配好后滅菌，保存于室溫，0.1 mol/L MgCl₂ 分成 500~1000 μl 每份，于 -20℃ 保存。

(6) 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.4)。

(7) 10% （m/V）SDS。

(8) 用于制備競爭性 RNA 的勻漿緩沖液：3 mol/L LiCl，6 mol/L 尿素，20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），10 mmol/L MgCl₂。500 ml 的緩沖液可供從 16 只老鼠的組織中提取用 RNA 。用 DEPC  處理水配制，不能高壓滅菌，制備后 24 內使用。4°C 保存。

(9) 用于制備競爭性 RNA 的溶解緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，1 mmol/L EDTA，1%（m/V）SDS。無菌條件下，室溫可保存幾天。

(10) 1 mol/L Tris 堿，滅菌后室溫保存。

(11) Tris/EDTA 平衡苯酚，4℃ 可保存 1~2 天。長期儲存應于 -20℃。當有機相變成淡橙色時應棄用。

(12) 氯仿 : 異戊醇（24 : 1)，磨口瓶中于室溫保存。

(13) 7.5 mol/L 乙酸銨，配制好后，用 0.2 μm 孔徑的濾器過濾除菌，4°C 保存。

(14) 70% 乙醇，室溫保存。

2. 剪接體分析用溶液

(1) 硅烷化溶液：溶于氯仿中的 15% 二氯二甲硅烷，用帶磨口塞的玻璃瓶在通風櫥中保存。

(2) 1 mol/L 乙酸鎂，配好后用 0.2 μm 孔徑的濾器過濾除菌，于 4°C 保存。

(3) 17 X TP8 緩沖液，即 850 mmol/L Tris-磷酸，將 108 g Tris 堿和 20.0 ml 85% 磷酸 (分析純）加入 800 ml 無菌水中，然后加水至 1 L。在 0℃ 的 pH 應該為 8.0，滅菌后 4℃ 保存。

(4) TPM8 緩沖液：50 mmol/L Tris-磷酸，在 0℃ pH 為 8.0，1.5 mmol/L 乙酸鎂。

(5) 20% ( m/V ) 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲雙叉丙烯酰胺）50：1：用一次性 0.2 μm 孔徑的濾器過濾，在無菌、帶螺蓋的瓶中于 4℃ 可保存 1 年。

(6) 10% 過硫酸銨（APS）和 TEMED。

(7) 酵母完整細胞剪接提取物。

(8) 放射性標記的前體 mRNA：放射性標記的肌動蛋白前體 mRNA 可以在體外以克隆的肌動蛋白 DNA 并經 HpaⅡ 內切酶消化的產物為模板轉錄得到。肌動蛋白前體 mRNA 有 92 nt 的外顯子 1309 nt 的內含子和 48 nt 的外顯子 2。以 40000~80000 cpm/μl 溶于水中，-20℃ 保存。

(9) 磷酸鉀緩沖液 pH 7.6：為制備 1 mol/L 的磷酸鉀儲存緩沖液，將 8.85 g KH₂PO₄ 和 75.8 g K₂HPO₄ 溶于 400 ml 水中，調整其 pH 為 7.6，然后加水補充至 500 ml，滅菌后室溫保存。0.1 mol/L 的磷酸鉀緩沖液由 1 mol/L 的磷酸鉀稀釋 10 倍而成，分成 500~1000 μl 每份，-20℃ 保存。

(10) 100 mmol/L ATP：500 mg ATP 溶于 5 ml 水中，先用 5 mol/L 再用 1 mol/L 的 NaOH 把 pH 小心的調至 6.8~7.2。100 mmol/L 的 ATP 由母液用無菌水稀釋而成，分成 200~500 μl 每份，于 -20℃ 保存。用前于 37℃ 水浴迅速融化，置冰上使用。

(11) 30% ( m/V ) PEG₈₀₀₀：稱取 30 g PEG₈₀₀₀ 加入 65~70 ml 溫水（50℃ ) 中，若需要，邊加熱邊攪拌使其溶解。溶液冷卻后，加水補充至 100 ml，滅菌。分成 1 ml 或 10 ml 每份，-20℃ 保存。

(12) 1 mol/L HEPES-KOH（pH 7.4）：用 0.2 μm 孔徑的濾器過濾除菌，于 -20℃ 保存。

(13) R 緩沖液：50 mmol/L HEPES-KOH ( pH 7.4 )，2 mmol/L 乙酸鎂。1 ml 每份于 -20℃ 或 -70℃ 保存。

(14) 含競爭性 RNA 的 R 緩沖液：對于 7.5 μl 的剪接反應，應有 7.5 μl R 緩沖液和 15 μg 競爭性 RNA ( 溶于 0.5~1 μl )。在剪接體分析前混合 R 緩沖液和競爭性 RNA。

(15) 染料液：10%（m/V）溴酚藍和二甲苯藍。

(16) 上樣緩沖液：217 mmol/L Tris-磷酸，0°C 時 pH 8.0，40% ( V/V ) 甘油，各 0.25% ( m/V ) 的溴酚藍和二甲苯藍，加 2.5 ml 17X TP8 緩沖液、2.5 ml 滅菌的甘油和 250 μl 染液到 4.75 ml 水中。分成 1 ml 每份，-20℃ 保存。

(17) 15% ( V/V ) 甲醇，5%（V/V）乙酸。螺口瓶中于室溫保存。

3. 內源性 snRNP Northern 雜交分析用溶液

(1) 10X TBE：890 mmol/L Tris-硼酸，25 mmol/L EDTA ( pH 8.3 )。室溫保存。

(2) 1 XTBE，8 mol/L 尿素：89 mmol/L Tris-硼酸（pH 8.3)，2.5 mmol/L EDTA，8 mol/L 尿素。

(3) 0.25XTBE：由 10XTBE 用去離水稀釋而成。

(4) 20X SSCP：2.4 mol/L NaCl，0.3 mol/L 檸檬酸鈉，0.40 mol/L 磷酸鈉（pH 7.0)。室溫存放。

(5) 去離子甲酰胺。

(6) 50X Denhardt 溶液：1%（m/V）水溶性聚庶搪 ( Ficoll，平均分子質量為 400000 Da )，1% ( m/V ) 聚乙烯吡咯烷酮（平均分子質量為 40000Da)，1% ( m/V）BSA。用 0.45 μm 孔徑的一次性濾器過濾后分成 20~50 ml 每份，于 -20℃ 保存。

(7) 單鏈鮭魚精 DNA (ssDNA )，10 mg/ml：在 1XTE 中溶解雙鏈鮭魚精 DNA 50 μg/μl。超聲處理以剪切 DNA，使之斷裂為 300 bp 的片段（用瓊脂糖凝膠電泳分析）。煮沸迅速冷卻，然后用 TE 稀釋到 10 μg/μl，分裝后于 -20°C 保存。

(8) Northern 印跡雜交液：50% ( m/V）甲酰胺，0.1%（m/V）SDS，5X SSCP，3X Denhardt 溶液，100 μg/ml ssDNA。-20℃ 保存，用前加熱到 60~65°C。

(9) 50 mmol/L EDTA（pH 8.0)，0.1 % ( m/V ) SDS。

(10) 放射性標記的探針：在本實驗中，用 snRNA 基因的雙鏈 DNA 片段來制備 Northern 雜交用探針。該 DNA 片段可以從克隆的 DNA 用內切酶消化并用瓊脂糖凝膠電泳純化而得來，也可以用 PCR 擴增的方法制備。snRNA 基因的 DNA 片段長度范圍為 200~1300 bp。DNA 片段經隨機 6 聚脫氧寡核苷酸引物反應被放射性標記，用 Klenow 聚合酶和放射性核苷酸（2.5 μl [ α-32P ] dATP，為 3000 Ci/mmol，10 mCi/ml )，25 μl 反應體系。加入 225 μl 50 mmol/L EDTA，0.1% SDS 終止反應。探針在 100°C 加熱 10 min 變性后立即加入到 15 ml 65°C 的雜交液中。

(11) 3X Northern 印跡洗滌緩沖液：3X SSCP，0.1% SDS。

(12) 0.1X Norhern 印跡洗滌緩沖液： 0.1X SSCP，0.1% SDS。

4. 設備

(1) 液氮 （N₂）。

(2) 離心機，勻漿器，旋轉真空濃縮儀。

(3) 各種試管、離心管。

(4) 玻璃板：一塊為 26.5 cm 高、20.2 cm 寬、0.4 cm 厚。帶凹口的玻璃板尺寸同前一塊，但帶一 2.2 cm 深、16.3 cm 寬的凹口。

(5) 聚四氟乙烯墊片和梳子：墊片和梳子厚度為 0.5 mm，梳子寬為 16 cm，高 2.7 cm，14 個齒，齒寬 8 mm，長 11 mm，齒間間隔為 3 mm。

(6) 黃色膠帶。

(7) 電泳槽。

(8) 電源：能提供 200 V 電壓和 50 mA 電流的電源，恒壓。

(9) 微型脈沖蠕動泵或同類產品。

(10) 平頭毛細管吸頭。

(11) Whatman 3 MM 濾紙。

(12) 硬質玻璃盤或不銹鋼盤（浸泡凝膠和洗 Nonhern 印跡用）：先用肥皂和水洗滌， 在 252℃ 干烤 4~5 h。然后用去離子水漂洗，空氣干燥。

(13) 電轉移裝置：可同時放兩塊凝膠，該裝置放在冷室中。

(14) 紫外交聯儀：三個 15 W 的紫外燈管相互間隔 8.5 cm，離樣品平面 35 cm。

(15) 微波爐或加熱盤 ( hot plate)。

(16) 雜交袋和密封器。

(17) 水浴振蕩器或雜交爐。

(18) X 射線片，壓片暗盒，增感屏和膠片處理設備。

(19) 凝膠干燥器（可選）。

二、操作方法

1. 制備剪接體分析用競爭性 RNA

(1) 戴無塵手套以避免手上 RNase 的污染。

(2) 從 8~16 只小鼠取出小腸和肝臟。一次處死一只小鼠并取出它的小腸和肝臟。 操作時要避免取到膽囊和胰腺，因為這些器官富含核酸酶。取出的小腸和肝臟應立即置于液氮中，在 -70℃ 可保存過夜，在液氮中最多可以保存 1 年。

(3) 準備勻漿。室溫下在一塊干凈的紙巾上解凍幾塊小腸。盡可能擠出小腸中的殘留物，把小腸剪成 5.08~7.62 cm 的小段，將其轉移至加有 10 ml 冰冷勻漿緩沖液的 50 ml 無菌的一次性聚丙烯離心管中。每只小鼠的器宮用 10 ml 勻漿緩沖液，如果緩沖液太少 RNA 的產量就會很低。肝臟可直接加到緩沖液中。

(4) 勻漿前，用 DEPC 處理水和乙醇洗滌勻漿頭。一次可勻漿 20~30 ml 的樣品，以中速對肝臟樣品勻漿 1 min，小腸勻漿 30 s。勻漿時間要求并不嚴格，主要依勻漿的情況而定。勻漿液應該很稠，沒有明顯可見的組織塊。結束后，勻漿液放在室溫。

(5) 離心去掉殘渣。勻漿液轉移到離心管中，于室溫、8500 g 離心 15 min 去掉殘渣。

(6) 沉淀 RNA。把勻漿液轉移到新的離心管中，避免吸到上清液上層的 1~2 ml 黏稠物和底部的殘渣。勻漿液放在冰上于冷室中過夜（至少 6 h，最多 2~3 天）。用高速離心機于 4℃、11000 g 離心 15 min 以離下 RNA 沉淀。

(7) 溶解 RNA 并用有機溶劑抽提。用 2.5 ml 溶解緩沖液溶解 RNA 沉淀，并轉移到一 corex 離心管中。戴上手套和防護鏡，穿上防護服，加等體積苯酚到溶解的 RNA 中。渦旋混合水相和苯酚溶液，再用高速離心機于 4℃、11000 g 離心 10 min 分離水相和黃色的苯酚層，把含 RNA 的水相轉移到干凈的 Corex 管中。加 1 ml 新鮮的溶解緩沖液到苯酚層中，重新抽提，合并水相。用等體積新的苯酚重新抽提合并的水相。加 1~2 倍體積的氯仿：異戊醇到抽提出的水相中，渦旋混合，離心分離水相和有機相。把上層的水相轉移到干凈的 Corex 管中。

(8) 用醋酸鈉和乙醇沉淀 RNA，加入 1/15 體積的 3 mol/L 醋酸鈉（pH 5.4) 到水相中，然后加入 3 倍體積的無水乙醇，混合，干冰上放置 10 min 或 -20℃ 過夜。高速離心機上于 4°C 11000 g 離心，棄上清。室溫下用 70% 的乙醇洗兩次，吸出 70% 乙醇后，用干凈的紙巾吸出剩余的乙醇。

(9) 溶解并重新沉淀 RNA。用冷水溶解 RNA，每個器官 0.25 ml，置于冰上。對于 16 只小鼠，每種器宮應有 3~4 ml 的 RNA 溶液。加 7.5 mol/L 醋酸銨到 RNA 溶液中，使其終濃度為 0.2 mol/L，混合后分成 400 μl 每個離心管。加 1.2 ml 無水乙醇到每管中，于 -70℃ 保存。

 (10) 制備競爭性 RNA，在 4℃ 離心 2 或 3 管沉淀的 RNA（14000~15000 g，10 min)。室溫用 70% 乙醇洗兩次，并用旋轉真空濃縮儀干燥沉淀。用小體積的水溶解 RNA 并合并 RNA，總體積約為 100~150 μl。測出 RNA 的濃度和純度（取出少量，稀釋 500 或 1000 倍，測出 λ₂₆₀ 和 λ₂₈₀ 處的光吸收值，λ₂₆₀ 1OD 相當于 40 μg/ml RNA)。競爭性 RNA 的母液濃度應為 20~30 μg/μl。OD₂₆₀/OD₂₈₀ 高于或等于 1.6 時，RNA 可用于分析實驗。這種溶解的 RNA 于 -70℃ 可保存兩年。

2. 灌制非變性凝膠

(1) 清洗玻璃板、梳子、墊片和硅烷化處理帶凹口的玻璃板，不要硅烷化另一塊玻璃板，否則電泳后分開玻璃板時會破壞凝膠。

(2) 把玻璃板和墊片安裝在一起，把無凹口的玻璃板平放，并放上墊片，墊片的一端與凝膠的底部平齊，把帶凹口的玻璃板放在上面，硅烷化的一面朝里面，從頂部到底部夾緊，用黃色膠帶包住兩塊板的底部及兩側，去掉夾子。

(3) 灌制凝膠。把裝好的玻璃板放在吸水紙上，稍微傾斜以減小灌好后凝膠的靜力學壓力。配制一塊或兩塊 3.2% 的凝膠，按順序加下列物質到 150 ml 的無菌燒瓶中：61.5 ml 室溫的水，4.8 ml 17X TP8，12.8 ml 丙烯酰胺儲存液。輕輕攪拌并慢慢加入 120 μl 1 mol/L 的乙酸鎂，120 μl TEMED 和 660 μl 10% APS。把混合液倒進兩塊玻璃板形成的槽中直至液面到帶凹口玻璃板的頂部，插上梳子，使每個齒全部浸在凝膠中。螺絲鉗夾緊使玻璃板和梳子壓在一起，再倒一些凝膠在梳子上。讓凝膠在室溫聚合 1~4 h。

(4) 開始剪接反應前至少 1 h，在冷室中把凝膠裝在帶循環泵的電泳槽中。倒入電泳緩沖液，使玻璃板底部浸入 2.5 cm，凝膠頂部浸入至少 1 cm。安裝并使蠕動泵的兩個管子與底部和頂部緩沖槽相連，使緩沖液從底槽向頂槽循環。用緩沖液輕輕地沖洗加樣孔。上樣前 160 V 預電泳半小吋，開始電流為 12.5 mA，然后降到 11 mA 并保持恒流。

3. 基本剪接體的分析

(1) 準備加有 R 緩沖液和競爭性 RNA 的小管。加 6 μl 競爭性 RNA 儲存液（20 μg/μl）到 60 μl R 緩沖液中，混合后各取 8.3 μl 分別加到 6 個 1.7 ml 的離心管中，離心管放在冰上。

(2) 按照順序在離心管中加入下列溶液以準備剪接反應（在冰上)：13.8 μl H₂O，1 μl 100 mmol/L DTT，3 μl 1 mol/L 的磷酸鉀鹽緩沖液，5.0 μl 30% PEG₈₀₀₀，1.5 μl 0.1 mol/L MgCl₂，1 μl 100 mmol/L ATP，20 μl 完整細胞提取物，混勻后離心 2 s。對于 0 時間點的樣品，取出 6.5 μl 反應混合物加到含 R 緩沖液和競爭性 RNA 的第一管中，冰上放置（放射性標記的前體 mRNA 以后要加到此樣品中）。

(3) 起始和終止剪接反應。反應混合物在 23℃ 水浴中放置 2~3 min，然后加入 5.5 μl 放射性標記的肌動蛋白前體 mRNA。反應體系中各成分的濃度分別為：60 mmol/L 磷酸鹽，3% (m/V) PEG₆₀₀₀，3 mmol/L MgCl₂，2 mmol/L ATP，20 mmol/L KCl，8 mmol/L HEPES，80 μmol/L EDTA，2.2 mmol/L DTT，8% ( V/V) 甘油，0.4 nmol/L 前體 mRNA，40~80 μg 提取物。加入放射性標記前體 mRNA 后，每 1 min 取出 7.5 μl 反應液依次加到含有 R 緩沖液和競爭性 RNA 的離心管中，樣品（R 緩沖液和競爭性 RNA 中）保持在冰上，讓最后取出的樣品（R 緩沖液和競爭性 RNA 中）在冰上孵育 10 min，同時加 1 μl 放射性標記的肌動蛋白前體 mRNA 到 0 時間點的樣品中，10 min 后，加 4 μl 冰冷的上樣緩沖液到每管樣品中，迅速混勻，冷室中離心 2 s。樣品上樣前一直要放在冰上。

(4) 上樣、電泳。上樣前關掉電源和循環泵，快速沖洗加樣孔，但加樣孔之間的凝膠條要保持直立。用平頭的微量吸頭每個樣品吸 15 μl，吸頭伸到加樣孔底部加樣，要避免碰到孔中的樣品。150~160 V 電泳 14~22 h，電泳 30 min 到 1 h 后打開循環泵使緩沖液循環流動。

(5) 取出凝膠。取凝膠前，剪兩張和無凹口玻璃板一樣大小的 Whatman 3 MM 濾紙，放在旁邊。關掉電源和循環泵，室溫拆下電泳裝置，去掉膠帶和墊片，小心取下帶凹口的玻璃板，凝膠會留在無凹口玻璃板。然后把一塊 3 MM 濾紙放在凝膠上，戴手套輕壓使 凝膠緊緊地和濾紙相連，在上面再放一張濾紙，翻轉帶凝膠的玻璃板，取下玻璃板，用濾紙托住凝膠。

(6) 使凝膠對 X 射線片曝光。用塑料膜（plastic wrap) 包住凝膠和濾紙，在 -70℃ 對 X 射線片曝光 ( 需增感屏）。凝膠可解凍/凍結數次，對幾張 X 射線片曝光。曝光后，凝膠可凍存在 -20℃ 用于以后的操作（干燥或把 RNA 轉移到尼龍膜上）。

(7) 多次曝光或對磷光板曝光，使凝膠中的 RNA 沉淀并使凝膠干燥。去掉塑料膜和第二張濾紙，用足量的 15％ 甲醇和 5% 乙酸浸泡與一張濾紙結合的凝膠，室溫緩慢地振搖 20 min。凝膠和濾紙會分離，但一去掉固定液，二者就會結合。用帶真空泵的吸管慢慢吸掉固定液，戴手套輕輕地把凝膠和濾紙轉移到兩張的 3 MM 濾紙上。在凝膠干燥器中于 60℃ 干燥 45~60 min。

(8) 清潔電泳槽。電泳時，緩沖液槽的鉑絲會結上沉淀，擦拭并用去離子水沖洗以去掉沉淀，空氣干燥。

4. Nonhern 印跡分析內源性 snRNP 復合物

(1) 采用非變性電泳分析 RNA 結合蛋白時通過預實驗確定使 RNA 復合物同其他的未結合的因子有效分離的最佳條件是非常有必要的。如剪接依賴復合體中的前體 mRNA 能通過 Northern 印跡與非結合的 snRNP 分開。在最初的實驗中，剪接依賴的復合體可以被放射性標記的前體 mRNA 示蹤，而非結合 snRNP 的位置可通過與 snRNP 特異探針的雜交來確定。在隨后的實驗中確定哪種 snRNA 存在剪接依賴復合體中，在非變性凝膠分析中采用有很低或沒有放射活性的轉錄物，但用于 Northern 印跡的凝膠處理則與這里所介紹的一樣。

(2) 處理凝膠 ( 使其適合轉移 RNA 到膜上）。凝膠對 X 射線片曝光后，去掉塑料膜和第二張 3 MM 濾紙，把與第一張濾紙結合的凝膠轉移到盛有足量 1X TBE、8 mol/L 尿素的耐熱玻璃盤中，液面高約 2 cm，室溫慢慢搖動 15 min。小心地取出濾紙并用與真空泵相連的吸頭吸掉液體，小心操作，以防破壞凝膠，加入新的 1X TBE，8 mol/L 尿素，再搖 15 min，同時剪 4 張和凝膠相同大小的 3 MM 濾紙，15 min 后，將兩張 3 MM 濾紙托在凝膠下面，吸掉液體，保持盤面水平，使凝膠完整地放在濾紙上面。在 8 mol/L 尿素中浸泡對于 snRNA 和前體 mRNA 從復合體上高效地轉移到膜上是非常重要的。

(3) 把凝膠和尼龍膜裝在轉移裝置。讓尼龍膜先在水中浸濕，然后浸沒在 0.25X TBE 中。把凝膠、尼龍膜、濾紙等裝在電轉移裝置上 ( 注意方向，以使 RNA 從凝膠轉移到膜上）。

(4) 在 115~120 V 電壓下轉移 1 h。轉移 1 h 后緩沖液的溫度會升到接近 37℃。

(5) 使 RNA 和膜交聯。拆下電轉移裝置，從膜上去掉濾紙和凝膠。用圓珠筆在膜上作一標記以顯示轉移時與凝膠接觸的一面。迅速用新鮮的 0.25X TBE 漂洗以洗掉凝膠碎片，把尼龍膜放在一干凈的玻璃皿上，帶標記的一面朝上。用一層塑料膜包住尼龍膜和玻璃皿。避免讓膜干燥，因為當膜是濕的時候 RNA 和膜最容易交聯。把玻璃皿放在離紫外燈管 35 cm 處，打開紫外燈照射 12 min。

(6) 使膜對 X 射線片曝光以獲得放射性標記前體 mRNA 的圖像并檢査轉移效率。如果在反應中用了放射性標記的前體 mRMA，可以用自顯影的方法檢査轉移的效率。讓膜在空氣中干燥 30~60 min，用一張 3 MM 濾紙托住尼龍膜，帶標記的一面朝上。用一層塑料膜包住尼龍膜和濾紙，讓它在 -70℃ 對 X 射線片曝光（放在壓片暗盒中）。

(7) 在低鹽和 SDS 中加熱以對尼龍膜進行預處理。將 500~1000 ml 0.1X 印跡洗滌溶液加入一個硬質耐熱玻璃盤中，用塑料膜蓋上，在微波爐中煮沸。小心地把膜浸沒在溶液中，蓋上塑料膜，在微波爐（低熱檔）中煮 10 min。室溫慢慢振搖 10 min。

(8) 預雜交。用兩張和尼龍膜一樣大小的 3 MM 濾紙夾住尼龍膜，一起放進一個于的雜交袋中，小心地取出濾紙，膜留在袋中。在雜交袋中加入約 20 ml 雜交液（沒有探針）。把袋平放在桌面上，擠出全部氣泡（氣泡會阻止探針的雜交），然后封上雜交袋。在 42℃ 振搖水浴（慢搖）中孵育至少 1 h。

(9) 雜交探針的準備見實驗材料部分。從水浴中取出雜交袋，切開一角，倒出雜交液。吸入含探針的雜交液，擠出氣泡（重要），密封雜交袋。在 42℃ 振搖水浴中孵育 12~24 h。

(10) 洗膜。切掉一角，把雜交液倒進放射性廢液罐中。把雜交袋平放在幾塊紙巾上 ( 下面墊上吸水紙），切開雜交袋，用平頭鑷子夾出雜交膜，放進一個裝有 500 ml 3X 印跡洗液的硬質玻璃盤中。室溫搖 10 min，把洗液倒進放射性廢液灌中，重復洗滌兩次。第四次洗滌加 500 ml 55°C 的 3X 印跡洗液，在 55℃ 水浴中揺 10 min。最后一次洗膜加 500 ml 55℃ 的 0.1X 印跡洗液，55℃ 水浴搖 10 min。

(11) 曝光。從洗液中取出雜交膜，用 3 MM 濾紙吸干，空氣干燥 30 min~1 h。用一張 3 MM 濾紙托住雜交膜，帶標記的一面朝上，用一層塑料膜包起來。放在壓片暗盒中于 -70℃ 對 X 射線片曝光 12 h~5 天。

(12) 去掉探針并以另一探針雜交。雜交膜依次至少可和 6 種探針雜交。曝光后，可以用步驟 (7) 的方法去掉原先的探針。要檢查探針去除的效率，可以在用下一種探針雜交之前讓膜在空氣中干燥，然后對 X 射線片曝光。