酵母功能互補實驗

實驗概要

本實驗將在構建了大蒜重金屬抗性基因表達載體并轉入大腸桿菌DH5α的基礎上，選擇鑒定準確的質粒轉化酵母細胞，對轉化子進行了PCR鑒定和RT-PCR分析，及重金屬抗性實驗。

主要試劑

YPD培養基，醋酸鋰，PEG(50%)，乙醇，少量酵母菌總RNA快速抽提試劑盒

主要設備

搖床，離心機，水浴鍋，PCR儀，電泳裝置

實驗材料

重組大腸桿菌DH5α(含大蒜重金屬抗性基因的克隆)

實驗步驟

1 酵母轉化

   1) 接種5 ml液體YPD，30℃下振蕩培養過夜；

   2) 計數過夜培養物細胞密度。以最終5X10⁶/ml的細胞密度接種100 ml YPD培養基；

   3) 置30℃，200 rpm/min振蕩培養至2 X 10⁷/ml，通常需要3-5小時；

   4) 用50 ml無菌離心管以3000 X g離心5 min，收獲細胞；

   5) 棄培養液，懸浮細胞于25 ml無菌水中，同上離心；

   6) 棄水，把細胞懸浮在1 ml的100 mmol/L的醋酸鋰中，轉懸浮物到一個無菌1.5 ml的離心管中；

   7) 離心5 sec沉淀細胞，吸出醋酸鋰；

   8) 懸浮細胞至終體積500 ul體積，其中大約含有400 ul的100 mmol/L醋酸鋰；

   9) 將1 ml單鏈單體DNA樣品煮沸5分鐘，快速在冰水中冷卻；

   10) 振蕩細胞懸浮液，取50ul樣品加到標記的離心管中，離心沉淀細胞，除去醋酸鋰；

   11) 按照下列成份配置“轉化混合液”：

        240 ul     PEG(50%)

        36 ul      1.0 mol/L醋酸鋰

          25 ul      單鏈載體DNA (2.0 mg/ml)

          50 ul      水和質粒(0.1-10 ug)

   12) 劇烈振蕩每個反應管至細胞完全混勻，通常要1 min；

   13) 30℃保溫30 min；

   14) 42℃熱激20- 25 min；

   15) 6000-8000 rpm/min離心15秒，除去轉化混合液；

   16) 吸0.2-1.0 ml無菌水加到每個反應管中，輕輕懸浮沉淀；

   17) 用等份的200 ul轉化混合液涂選擇平板。

2. 轉化子的篩選

轉化的酵母菌株涂到缺Leu的SD培養基上，30℃培養72小時。挑取陽性克隆。對陽性克隆進行菌落PCR鑒定。

3. 酵母轉化子的RT-PCR分析

根據少量酵母菌總RNA快速抽提試劑盒的說明書進行：

   1) 將酵母菌(≤5 X 10⁷)移入離心管中，離心10 sec，去上清。

   2) 加入500 ul DY液，徹底振蕩懸浮；

   3) 加200 ul Lyticase混勻，30℃溫育15-30 min，500 X g離心5 min，棄上清；

   4) 加500 ul TCL液，立即蓋蓋，高速振蕩5 min，12000 X g離心3 min，保存上清；

   5) 加入上清的1/2體積的75%的乙醇，徹底混勻，移入吸附柱，離心30 sec棄濾液；

   6) 加500 ul RP液，離心30 sec，棄濾液；

   7) 加500 ul W3液，靜置1 min，離心15 sec，棄濾液；

   8) 離心1 min；

   9) 加50 ul H₂O，靜置1 min；

   10) 離心1 min。

4. 重金屬抗性實驗

   1) 挑取轉化的酵母單菌落于30℃培養酵母24-48 hr；

   2) 調節酵母的濃度至OD值1.0，然后分別稀釋10倍、100倍、1000倍后，各取2ul于含有不同濃度重金屬離子的SD培養基(Leu)上。重金屬濃度分別為：

       Na₃AsO₄：0，100 umol/L，300 umol/L和500 umol/L，1000 umol/L

       CdCl₂：0，50 umol/L和100 umol/L}，30℃培養72 hr ；

   3) 觀察結果。