酵母原生質體制備

實驗材料 酵母

試劑、試劑盒 YPD酵母消解緩沖液山梨醇抽提緩沖液貯存緩沖液液氮

儀器、耗材 搖床水浴鍋轉子離心機培養箱

實驗步驟

1.   將酵母菌接種于YPD培養基（100 ml 到20 L），劇烈搖動或強制通氣條件下培養至對數中期（OD600≈1~5）。培養物在預稱重的離心瓶中于4℃， 1 500 g 離心5 min。

2.  確定酵母細胞的濕重，它與壓緊的細胞體積大致相同。在所有的后續步驟中菌體的量將當作1體積來考慮。

3.  細胞用2~4體積冰水重懸，并立即于4℃，1 500 g 離心5 min，加入1體積含30 mmol/l DTT的酵母消解酶緩沖液重懸細胞、室溫放置15 min。

4.  于4℃，1 500 g 離心5 min，菌體用3體積的酵母消解酶緩沖液重懸。

5.  在每毫升原壓緊細胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30℃水平搖床以大約50 r/min 的轉速溫育40 min，通過水滲破法確定菌體是否完全轉變為原生質體，如果原生質體化不完全，應繼續溫育直到完全。

6.  1 500 g 離心原生質體5 min，小心棄上清，原生質體球沉淀塊不如細胞沉淀塊般緊密。

7.  用2體積冰冷的酵母消解酶緩沖液輕輕重懸沉淀，原生質體1 500 g 離心5 min，重復2次。

8.  用2體枳酵母消解酶緩沖液輕輕重懸沉淀，不要試圖得到均一的懸液，只需將沉淀物從管壁上洗下來，懸轉10~20次，于1 500 g 離心10 min回收原生質體。

9.  用玻璃棒仔細將原生質體沉淀重懸于1體積裂解緩沖液中。

10.  在Dounce 勻漿器中用最緊密的研杵，沖擊15~20次以裂解原生質體。

11.  往超離心管中加入一半管體積原生質體裂解液，再加等體積的抽提緩沖液，將離心管封口。于4℃在旋轉輪或搖床上輕輕倒轉離心管15~30 min。

12.  于4℃，45Ti 轉子上100 000 g 離心90 min。收集上清，在100體積貯存緩沖液中透析2~4 h。將透析袋轉移到100體積新鮮的貯存緩沖液中，再透析2~4 h。

13.  取出幾微升透析液，用水作1 ：1 000稀釋，測定電導率。如果和類似稀釋度的貯存緩沖液相等或低于一定值時（通常100~250 mmol/l NaCl），繼續步驟14，否則繼續透析。

14.  于4℃，10 000 g 離心10 min。收集透析液上清。分成小份放在液氮中冷凍，于 -80℃貯存。