酵母雙雜交系統的實驗步驟

酵母雙雜交系統的實驗步驟

1. 將報告基因p8op-LacZ轉化酵母EGY48菌株，用培養基SD/-Ura篩選。

2. 同時構建DNA文庫，并純化足夠的質粒以轉化酵母細胞。

3. 構建DNA-BD/靶蛋白質粒pLexA-X，作為釣餌（bait）。

4. 將上述釣餌質粒pLexA-X轉化EGY48（p8op-LacZ）細胞株，用SD/-His/-Ura篩選;并用固體誘導培養基SD/Gal/Raf/-His/-Ura檢測此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活報告基因的活性，以及對酵母細胞是否具有殺傷毒性。

轉化質粒 選擇培養基 克隆生長情況 說明

（含有Gal/Raf）

pLexA-Pos SD/-His，-Ura 藍 陽性對照

pLexA SD/-His， -Ura 白 陰性對照

PlexA-X SD/-His， -Ura 白 沒有直接激活活性

PlexA-X SD/-His， -Ura 藍 具有直接激活活性

PlexA-X SD/-His， -Ura 菌落不能生長 酵母細胞毒性

能夠自動激活報告基因，則設法去除其激活活性部位、或者將LacZ報告基因整合入基因組，

1.4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信號作用減少。

4-2. 如果pLexA-X雖然不會自動激活報告基因，但對酵母宿主細胞有毒性，則需要與純化的文庫DNA同時轉化酵母。

5. 如果pLexA-X不自動激活報告基因，也不具有毒性，則可以在純化的文庫DNA同時、順序轉化酵母細胞，并檢測質粒轉化效率。

轉 化 質 粒 SD固體培養基 LacZ表型

對照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 藍

對照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 藍+pB42AD-T

實 驗 pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待測+pB42AD-文庫

5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培養基選擇陽性共轉化子，并擴增，使宿主細胞中的質粒在誘導前達到zui大拷貝數。

5-2. 上述重組子轉至含X-gal的固體誘導培養基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，觀察LacZ及Leu報告基因的表達情形，藍色克隆即為陽性。白色克隆為假陽性，說明Leu雖有表達，但b-半乳糖苷酶無表達。

5-3. 同時用LacZ、Leu兩個報告基因的目的，是為了盡可能消除實驗的假陽性誤差，譬如：AD融合蛋白不與目標蛋白結合，而直接與啟動子序列結合域結合等情況。由于2個報告基因的啟動子不同，出現上述假陽性的幾率就大大減少了。

5-4. 將藍色陽性克隆進行1次以上的劃種，盡可能分離克隆中的多種文庫質粒。

6. 陽性克隆的篩選

6-1. 隨機選取50個陽性克隆，擴增、抽提酵母質粒，電轉化E.coliKC8宿主菌，抽提大腸桿菌中的質粒，酶切鑒定是否具有插入片段及排除相同的文庫質粒。

6-2. 如果重復的插入序列較多，可另取50個陽性克隆來分析。zui后得到數種片段大小不同的插入序列，再轉化新的宿主細胞，檢測是否仍為陽性克隆。

7. 用質粒自然分選法（Natural Segregation）篩除只含有AD-文庫雜合子的克隆

7-1. 將初步得到的陽性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養基，培養1-2天，含有HIS3編碼序列的BD-靶質粒在含有外源His培養基中，將以10%-20%左右的頻率隨機丟失。

7-2. 將上述克隆，轉鋪固體培養基SD/-Trp/-Ura，30°C孵育2-3天。

7-3. 再挑取生長的單克隆，轉入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養基中，篩選His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文庫雜合子的重組子。

7-4. 將His表型缺陷的克隆轉化固體誘導培養基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以驗證AD-文庫能否直接激活報告基因的表達，棄去陽性克隆，保留陰性克隆。

8. 酵母雜合試驗（Yeast Mating）確定真陽性克隆

如下表所示，在酵母EGY48及其對應的YM4271宿主細胞中分別轉入相應的質粒或文庫DNA，通過雜合實驗確篩選pLexA-靶DNA與pB42AD-文庫確實具有相互作用的真陽性克隆。

質粒1

（in YM4271） 質粒2

（in EGY48） LacZ表型 Leu表型

pLexA pB42AD 白 不能生長

pLexA-靶DNA pB42AD 白 不能生長

pLexA pB42AD-文庫 白 不能生長

pLexA-靶DNA pB42AD-文庫 藍真 陽 性

pLexA-Lam pB42AD-文庫 白 不能生長

9. 陽性克隆的進一步篩選和確證

9-1. 擴增初步確定的陽性克隆，提取酵母DNA。它既含有酵母基因組DNA，也含有3種轉化的質粒DNA。

9-2. 將上述DNA電轉化E.coli KC8。由于在大腸桿菌中，具有不同復制起始調控序列的質粒不相容;同時利用營養缺陷型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養基上，只有含有AD-文庫質粒的轉化菌才能生長，將其擴增、并提取質粒DNA，酶切鑒定。

9-3. 用pLexA-靶DNA與pB42AD-庫DNA一一對應、共轉化只含有報告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板擴增，并與后面的誘導板形成對照，說明報告基因的表達與誘導AD融合蛋白的表達有關，再確證LacZ、Leu報告基因的表達。

9-4. 擴增與靶DNA相互作用的文庫DNA，進行序列分析及進一步的結構、功能研究。

10. 對雙雜交系統陽性結果的進一步研究

10-1. 用不同的雙雜交系統驗證

10-1-1. 將載體 pLexA與pB42AD互換后進行雙雜交實驗。

10-1-2. 選擇不同的雙雜交系統，如：以GAL4轉錄激活子為基礎的雙雜交系統。

10-1-3. 將文庫質粒移碼突變后，再與靶質粒作用，報告基因是否仍能被激活。

10-1-4. 去除或突變特定結合位點，定量檢測b-半乳糖苷酶水平，比較作用強度變化。

10-2. 用試劑盒提供的引物測定插入片段的DNA序列，證明其編碼區域。

10-3. 用其它的檢測方法，如：親和色譜法或免疫共沉淀法來證明雙雜交系統篩選的蛋白之間的具有相互作用。

10-4. 進一步研究靶蛋白與篩選蛋白之間的功能關系