酵母感受態細胞制備實驗——化學法

釀酒酵母

YPDA液體培養基蒸餾水甘油二甲基亞砜

培養皿離心機離心管冰箱

一、試劑與耗材

1.  試劑
 
細菌用-酵母提取物（Fisher）、 細菌用-蛋白胨（Fisher）、葡萄糖（Fisher）、細菌用-瓊脂粉、去離子水、甘油(Sigma)、二甲基亞砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸鋰(Sigma)、鮭魚精子細胞DNA(Invitrogen)、酵母無氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-嗎啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。
 

2.  儀器
 

水浴鍋(VWR)、離心機(Eppendorf)、30℃搖床與恒溫培養箱(VWR)、培養皿。

二、 試劑配方
 

1.  YPDA液體或固體培養基
 

（1）1%酵母提取物： 10 g/L
 

（2）2%胰蛋白胨： 20 g/L
 

（3）2%葡萄糖：20 g/L
 

2.  轉化液
 

（1）聚乙二醇3350(50 % (w/v)：260 ul
 

（2）1 M醋酸鋰：36 ul
 

（3）SsDNA（10 mg/ml）：10 ul
 

（4）質粒：3 ul
 

（5）總計：360 ul
 

3.  YNB+ MA 培養基（100 ml）
 

（1）YNB：0.67 g
 

（2）2-(N-嗎啉代) 乙磺酸（20mM ）：0.39 g
 

（3）腺嘌呤：0.01 g
 

（4）瓊脂粉：2g
 

（5）葡萄糖：2g

三、制備步驟
 

1.  在轉化實驗的兩天前，于YPDA培養基的平皿上活化酵母菌株。
 

2.   轉化前一天，挑取活化的酵母細胞（單克隆）于YPDA液體培養基中，30℃，200 rpm培養過夜。
 

3.  將培養過夜的酵母細胞液按1：3的比例轉接與新的YPDA液體培養基中，于30℃搖床內，200 rpm培養4 h。
 

4.  3 000 g 離心 5分鐘收集酵母細胞，用0.5倍體積的無菌水洗酵母細胞。
 

5.  再次3 000 g 離心 5分鐘。
 

6.  用0.01倍體積的無菌水重懸酵母細胞，并轉入適宜的離心管中，20℃，3 000 g 離心 5分鐘。
 

7.  用0.01倍體積的無菌細胞懸浮液(5 % v/v 甘油，10% v/v 二甲基亞砜)重懸酵母細胞。
 

8.  將重懸的酵母細胞按50 ul分裝到1.5 ml離心管中。
 

9.  將管放入塑料盒或者紙盒中（逐步梯度冷凍能夠增強酵母的存活率）。
 

10.  將裝有酵母細胞的盒子放入-80℃冰箱。（細胞在-80℃能夠保存一年以上）。
 

一、化學法試劑配方：

1.  YPDA液體或固體培養基

（1）1%酵母提取物： 10 g/L

（2）2%胰蛋白胨： 20 g/L

（3）2%葡萄糖：20 g/L

2.  轉化液

（1）聚乙二醇3350(50 % (w/v)：260 μl

（2）1 M醋酸鋰：36 μl

（3）SsDNA（10 mg/ml）：10 μl

（4）質粒：3 μl

（5）總計：360 μl

3.  YNB+ MA 培養基（100 ml）

（1）YNB：0.67 g

（2）2-(N-嗎啉代) 乙磺酸（20mM ）：0.39 g

（3）腺嘌呤：0.01 g

（4）瓊脂粉：2g

（5）葡萄糖：2g

二、參考文獻
 

1.  Gietz R.D., Schiestl R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4.
 

2.   Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.