1）將目的基因亞克隆到帶恰當的選擇標記的YRp或YCp質粒上。
2) 在基因內部的兩個限制酶酶切位點上切割以產生缺口，在缺口的兩側各留下40?200bP的同源區域，將得到的質粒片段進行凝膠純化。缺口或切口盡可能靠近突變
位點。
3) 如果用于致突變，通過PCR制備所需的致突變片段。如果是用來拯救或定位染色體等位基因，進行步驟4。
4) 將1μg帶缺口的質粒DNA和PCR產生的片段共同轉化入帶適當標記的酵母菌中。 如果是用缺口修復來拯救基因組等位基因，就單獨轉化帶缺口的質粒。
5) 將轉化子接種在專用于質粒標記選擇平板上，鑒別成功修復的結果。對于恢復或定位染色體等位基因，利用質粒分離技術鑒別選擇標記不穩定的轉化子。 如果突變正好位于缺口區域內，突變將會被修復的質粒攜帶。當突變位于缺口的附近時，其結果取決于交叉發生在什么部位。突變距離缺口區域越遠，含有突變的質粒就會越少。
6) 如果以PCR為基礎的突變作為突變發生的方案，篩選具有突變表型的轉化子。 展開 | 