酵母菌細胞融合實驗

實驗概要

學習酵母菌原生質體制備和再生技術，為了解酵母菌為材料的外源基因轉移等技術奠定基礎。

實驗原理

酵母菌如釀酒酵母，在遺傳學和分子生物學的研究中有很大作用，尤其是近些年來，隨著科技的進步，酵母菌的遺傳操作如轉化、基因克隆和外源基因在酵母受體中的表達等技術都有了突破性的進展。作為受體系統的酵母菌原生質體在這些技術中有獨特的地位。這種經溶菌酶處理脫壁后的細胞（脫壁不完全者稱原生質球）既可以作為不同種屬間細胞融合的母體，實現細胞器等大結構的轉移，又可作為外源基因轉移的受體，大大提高基因轉移的效率。這些新技術不僅促進了酵母菌遺傳學的發展，而且很多已應用到構建新的釀酒業酵母。

本實驗以釀酒酵母為材料，進行原生質體的分離制備和再生。酵母菌原生質體的制備一般采用蝸牛酶、酵母溶菌酶或其它細胞壁溶解酶類。分離制備過程受許多因素的影響，如不同菌株的生長期、細胞濃度、溶菌酶類型和用量、處理時間和溫度等。所以整個實驗過程設計應綜合考慮各種因素，才能獲得較好的效果。分離制備的原生質體在適當的再生培養基上培養時，可以再生出細胞壁而恢復完整細胞狀態，即完成再生過程，這也是以原生質體為受體的所有實驗技術最終能實現的一個關鍵步驟。

在原生質體制備中，應選用適當生長時期的菌體作為分離的材料。一般來說，對數生長期的酵母菌細胞易脫壁，靜止期細胞較難甚至不可能形成原生質體。而不同菌種的生長對數期也略有差異，一般在12～16小時之間（10⁸細胞/ml）。制成的原生質體懸浮液在0℃條件下保存4～6小時，不會影響融合再生率。所以欲進行原生質體融合，應在制備后盡快進行，以免時間過長，影響再生。

分離過程中采用的β-巰基乙醇可使細胞壁組分中的二硫鍵破壞，使蝸牛酶易于分解細胞壁。此外，滲透壓的調節可用0.8mol/L山梨醇、16％蔗糖，或者0.6mol/L KCl溶液。

主要試劑

液體YEPD：1000 ml 分裝四瓶（蛋白胨 2%  葡萄糖 2%  酵母浸膏 1%  自然pH 值）

高滲YEPDS：1000 ml (加入  KCl  52.5 g)  YEPD 液體培養基中加入2%瓊脂

PB   2000ml                                                                                                                                                                                

檸檬酸：21克溶于1000毫升蒸餾水中   磷酸氫二鈉：143.256克溶于2000毫升蒸餾水中 

        取檸檬酸溶液678毫升取磷酸氫二鈉溶液1322毫升混合得2000毫升PB

高滲PB：取1000毫升PB加入KCL52.185克

PEG-CaCl：聚乙二醇6000  40克加入至100毫升高滲PB溶液中使氯化鈣為0.4mol/l

0.2%β-巰基乙醇，無菌過濾器過濾

蝸牛酶液：1.5% 蝸牛酶用高滲PB緩沖溶液配制，無菌過濾器過濾

淀粉YEPDS：1000 ml (加入  KCl  52.5 g)  YEPD 液體培養基中加入2%瓊脂（蛋白胨 2%  淀粉 2%  酵母浸膏 1%  自然pH 值）

主要設備

恒溫搖床、恒溫水浴、顯微鏡、臺式離心機、培養皿、試管、過濾滅菌裝置。

實驗材料

菌種：釀酒酵母SP-48、L-酵母。　

實驗步驟

1. 原生質體的制備:
   1)    菌種培養:將酵母菌sp-48和L-酵母活化轉接新鮮斜面.自新鮮斜面分別挑取一環sp-48酵母和L-酵母轉接入250ml完全培養基中，30℃振蕩培養16-18h；
   2)    收集細胞：取上述對數生長期的酵母細胞培養液5ml，4000r/min離心10min，棄上清液.檸檬酸-磷酸緩沖液(PB)洗兩次，收集菌體；
   3)    預處理：取5ml0.2%β-巰基乙醇PB緩沖液于裝有酵母泥的離心管中，30℃保溫10min，以1000轉/分離心10min，傾去上清液；
    4)    脫壁：在裝有處理過的SP－48，L-酵母菌泥的兩只離心管中，分別加入5ml  1.5%蝸牛酶-PB溶液置30℃水浴中處理,取樣鏡檢，當 80%以上的細胞轉變為原生質體  2500r/min離心10min，用PB液離心洗滌，洗去酶液，加入4ml高滲PB液制成10⁶/ml以上的原生質體液，測定形成率。

原生質體形成率=(酶解前菌落計數-未形成原生質體菌數)/ 酶解前菌落計數×100%

2. 原生質體再生率測定 :

將制備的原生質體稀釋到2-3×10⁷個/ml,各取1ml原生質體液用PB液稀釋后涂布在高滲完全培養基（YEPDS）和完全培養基(YEPD)。30℃培養2天計算菌落數,酶解前的菌液直接用無菌水稀釋涂布完全培養基，培養后計算菌數。

原生質體再生率％＝(再生平板得菌總數-未形成原生質體總數)/(酶解前總菌數-未形成原生質體總數)乘以100%
3. 原生質體的融合:
   1) 將L-酵母的原生質體用紫外線滅活2分鐘，在黑暗中保存20分鐘， 2500rad/min離心10min，用2ml高緩沖液懸浮；
   2) 將兩菌的原生質體懸浮液混合，離心，向沉淀中加入3mlPEG-CaCl₂，振蕩均勻，30℃處理20min, 鏡檢并觀察融合情況；
   3) 用高深緩沖液洗滌菌體沉淀， 2500rad/min離心10min；
   4) 立即用高深緩沖液稀釋，取融合原菌液及10^-1稀釋液各0.1ml菌液，涂布于再生培養基平板上。

4. 融合子的檢出:

將融合液涂布在加有0.01%的放線菌酮和青霉素(100IU/ml)的再生培養基上，30℃進行培養2天，計算融合率。   

融合率=融合子/完全培養基平板上再生原生質體數×100%

注意事項

整個分離制備和再生過程于無菌條件下操作。