12、蛋白降解
分泌表達的目標蛋白比胞內蛋白確實容易被降解。可以嘗試以下幾種辦法：1、盡可能降低培養液的pH值減少酶活，酵母生長pH值比較廣，4～7都可以試一下；2、多試幾種蛋白添加劑，充當酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最適下罐（搖瓶也一樣），寧可少表達點也別給降解光了。實在沒辦法，只好換菌株或做pcr突變酶切位點（當然不能影響表達和蛋白活性）。
Several strategies have been reported as effective in minimizing the
proteolytic instability of specific foreign proteins secreted into the
P.pastoris culture medium.
1）、The first is adding to the culture medium of amino-acid rich
supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product
degradation possibly by acting as execess substrates for one or more
problem proteases.
2）、 The second strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.
3）、The third strategy involves elevating the level ofammonium in the
culture broth adequately, which is explained by the hypothesis that
portease activity is induced under nitrogen starvation.
The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.
連續兩個或兩個以上的堿性氨基酸相鄰的結構，如果有的話，在這一位點是很容易被蛋白酶切斷，產生偏小的多肽。
13、換液
通常用BMGY和BMMY是要換液的，但也可以不用換液。培養到菌液渾濁后，直接向BMGY里加甲醇誘導就行了。GS115在第4天達到了最高表達量。換液不是必要的，適量甘油的存在有時反而會使表達量提高，
10ml生長培養后，等體積換液。我用250三角瓶，裝量25mlBMGY發酵2天，再取0.5ml加入BMMY（250三角瓶，裝量25ml)中誘導發酵.
BMGY和BMMY的換液方式有2種：
1）一種是離心換液，即在生長培養結束后，轉移到滅菌大離心管中，4000rpm室溫離心5分鐘后，用BMMY洗下菌體，再轉移到搖瓶，整個過程均用滅菌移液管操作。另外2）一種是靜止換液，即在生長培養結束后，將搖瓶在無菌室靜止4小時后，直接在酒精燈旁傾倒培養液，再加入誘導培養基，此種方法的缺點有少量生長培養基殘留。
是離心換液或者靜止換液，到底那個好，只有根據自己的實驗結果來考量。如果只是從防治污染的角度來說，靜止換液也好一些，因為操作畢竟少一些，速度也快。
總之，無論是取樣還是補料、加甲醇，盡量用滅菌的移液管（因為比較長，不容易引起污染）。當然，微量的如200ul，還是用移液器加（快而準確），可以在瓶口處往瓶內加入100％甲醇等。用新開啟的分析純甲醇，我們都沒有過濾或者其他處理，一直放在無菌室里面，每次直接用滅菌TIP吸取加入搖瓶就可以了。實驗室里也有人試過用膜過濾，結果膜都溶解了。
14、上罐表達
放罐時OD能達到400左右，生長過程最高OD500左右，重組蛋白發酵水平大約300-400mg/L。30g/L甘油初始培養OD約40左右，流加約420g/L甘油后，菌體密度達到最高約500。開始誘導后，起初3－5h之內流加的甲醇很少，發酵體積變化小，但是菌體的OD值是快速下降的，一般是原來的90%左右，每次都是這樣，確切原因我們也還不清楚，估計是酵母從高速生長轉向營養饑餓過程中，菌體形態發生很大變化，比如大小、含水量、折光率等。隨酵母逐漸適應利用甲醇為碳源，mut＋型酵母的誘導可以將甲醇的流速逐步提高，此時仍然能發現OD值下降，我們認為這主要是發酵體積增加的原因造成的。我們誘導過程一般增加約40%的體積7L到10L，最終OD值約為最高OD值的80%左右，簡單換算一下，應該知道菌體生物量增加約1/7。其實，這和畢赤酵母代謝甲醇途徑也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分繼續氧化成甲酸進而生成CO2，產生菌體所需的能量，另一部分可以被菌體同化，進入小分子碳架的合成途徑，提供菌體生長所需的碳源。