一、酵母 DNA 微量制備（40 ml)1.在 125 ml 三角瓶中用 40 mlYPD 培養液在 30°C 條件下培養細胞達最大生長量（過夜)。 2.將上述培養物移入螺蓋離心管，用醫用離心機或 SarvallSS-34 轉頭以 5000r/mm 離心 5 min，棄去上清液。 3.將細胞懸浮在 3 ml 的 0.9mol/L 山梨醇-0.lmol/LNa2EDTA(pH7.5) 溶液中。 4.加 0.lml 的 2.5 mg/ml 消解酶 100T，置 37°C 保溫 lh。 5.用醫用離心機或 SorvallSS-34 轉頭以 5000r/min 離心 5 min，棄去上清液。 6.將細胞重懸于 5 ml 的 50 mmol/LTris-HC1(pH7.4)-20 mmol/LNa2EDTA 溶液中。 7.加 0.5 ml 的 10% SDS，混勻。 8.置 65°C 保溫 30 min。 9.加 1.5 ml 的 5mol/L 乙酸鉀溶液，在冰浴中放置 lh。 10.用 SorvallSS~34 轉頭以 10000r/min 離心 lOmin。 11.將上清液轉移至干凈的塑料離心管中，室溫下加入兩倍體積的 95% 乙醇，混勻，以 5000?6000r/min 室溫離心 15 min。 12.棄上清液，將沉淀物干燥，然后懸浮在 3 mlTE 緩沖液（PH7.4) 中，此操作可能需要幾個小時。 13.用 SorvallSS-34 轉頭以 10000r/mm 離心 15 min，將上清液轉移到一個新試管，棄沉淀物。 14.加入 150jul 的 lmg/irilRNaseA 溶液，在 37°C 下保溫 30 mino 15.加入一倍體積的 100% 異丙醇，輕輕混勻。取出呈松散纖維狀的沉淀物，無需離心，讓其自然干燥。 16.將沉淀物懸浮在 0.5 mlTE 緩沖液（pH7.4) 中，置 4°C 保存。酵母 DNA 的終濃度大約在 ZOOjug/ml。如果最后的溶液不澄清，用異丙醇再次沉淀 DNA 或用 SorvallSS-34 轉頭以 10000r/min 離心 15 min。 二、酵母 DNA 微量制備（5 ml）1.接種酵母于 5 ml YPD 中，置 30°C 培養過夜。 2.用醫用離心機以 2000r/min 離心 5 min 沉淀細胞，棄上清液。 3.將細胞懸浮在0.5 ml 的 lmol/L 山梨醇-0.lmol/LNa2EDTA(pH7.5) 緩沖液中，并轉到一支 1.5 ml 離心管中。 4.加入 0.02 ml 的 2.5 mg/ml 的消解酶 100T 溶液，置 37°C 保溫 lh。 5.離心 lmin。 6.棄上清液，把細胞用 0.5 ml 的 50 mmol/LTrls-Ha(pH7.4)-20 mmol/LNa2EDTA 溶液懸浮。 7.加 0.05 ml 的 10%SDS，混勻。 8.置 65°C 保溫混合物 30 min。 9.加 0.2 ml 的 5mol/L 乙酸鉀，把離心管在冰浴中放置 lh。 10.離心 5 min 。 11.將上清液轉移到一潔凈微型離心管，室溫下加入等體積的無水異丙醇，混勻，放置 5 min。短暫離心（10s) 棄上清液，讓沉淀自然干燥。 12.用 0.3 mlTE 緩沖液（pH7.4) 重新懸浮沉淀。 13.加 15ul 的 lmg/ml 的 RNaseA 溶液，置 37°C 保溫 30 min(此步可任意選擇）。 14.加 0.03 ml 的 3mol/L 乙酸鈉，混勻，用 0.2 ml 的無水異丙醇沉淀，再短暫離心收集 DNA。 15.棄上清液，自然干燥，用 0.1~0.3 ml TE 緩沖液（pH7.4) 重新懸浮 DNA。 16.在使用限制性內切酶酶解 DNA 之前，有必要將最終溶液離心較長時間（15 min) 以便除去可能抑制酶解的不溶性物質。 三、10 min 制備酵母 DNA大腸桿菌或酵母轉化質粒的制備1.在質粒 DNA 選擇性培養基（如 SC-ura) 中，置 30°C 培養少量培養物（至少 1.4 ml) 過夜。 2.將培養物轉人一支 1.5 ml 的微型離心管，離心 5s，收集細胞。 3.小心傾去上清液，輕彈離心管，使沉淀重新懸浮于殘余培養液中。 4.加人 0.2 ml 的 2%TritonX-100，1%SDS，100 mmol/LNaCl，10 mmol/LTris-HCl(pH8)，lmmol/LNa2EDTA; 加入 0.2 ml 的苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1); 加人0.3 g 酸洗過的玻璃珠。 5.振蕩 2 min。 6.離心 5 min。 7.用 1~5ul 含 DNA 的水相轉化 0.2 ml 的大腸桿菌受體菌，用 15W 水相轉化酵母菌。 用于 Southern 分析的基因組 DNA 分離1.用 YPD 培養基，置 30°C 培養 10 ml 酵母至最大生長量。 2.用醫用離心機離心 2 mm，棄上清液，收集細胞，用 0.5 ml 蒸餾水重新懸浮，將細胞轉入 1.5 ml 微型離心管中，離心 5s 收集細胞。 3.重復第 2) 步。 4.重復第 2) 步。 5.加 0.2 mlTE 緩沖液（pH8)，振蕩 3~4 min。 6.離心 5 mm，將水相移至潔凈試管，加 lml 的無水乙醇，上下顛倒，混合均勻。 7.離心 2 min，棄上清液，懸浮在 0.4 ml TE 緩沖液和 3ul 的 10 mg/ml RNase A 溶液，置 37°C 保溫 5 mm, 加入 10；ul 4 mol/L 乙酸銨和 lml 的無水乙醇，上下顛倒，混合均勻。 8.離心 2 min，棄上清液，自然干燥后，用 50ul 的 TE 緩沖液懸浮，每份樣品用 lOul 進行 Southern 印跡分析，每份用量 2~4ug DNA。 四、制備酵母基因組 DNA: 玻璃珠法1.用 5 ml 培養基（完全培養基或選擇性培養基）在 30°C 下，搖床培養過夜。 2.轉移培養物至 13 mmX100 mm 的玻璃離心管中，用臺式離心機以 1500r/min 離心 5 min，收集細胞。 3.用 3 ml 無菌水洗細胞，同上離心。 4.用 500ul 裂解緩沖液再次懸浮。 5.加入干凈的玻璃珠（約 1.5 ml 離心管的 2/3 體積）和 25ul的 5mol/L Naa。 6.以最高速振蕩 lmin。 7.以 2000r/min 離心 2 min。 8.用 P-1000 移液器轉移上清液至 1 支 1.5 ml 離心管。 9.加入 500ul 苯酰，振蕩，離心 lmin。用 P-1000 移液器吸取水相（上層），轉移至潔凈離心管，加入 500ul SEVAG(氯仿：異戊醇，24:1)，同上振蕩，離心，抽提。 10.加人 lml 預冷的 95% 乙醇，在 -20°C 下沉淀 lh。 11.以最高轉速離心 5 min 沉淀 DNA，棄上清液，用 70% 乙醇清洗，最后懸浮在 250ul TE 緩沖液中。 12.加的 EDTA-Sark 和 5ul 的蛋白酶 K(10 mg/ml)，至 37°C 保溫 30 min。 13.加 250ul 5mol/L 乙酸銨，重復 9)、10) 步驟。 14.收集 DNA，用 70% 乙醇洗，懸浮于 100ul 的 TE 緩沖液（每個酶解反應使用約 10ul）。 展開 | 