| 實驗步驟 | 1.培養 3~6L 細胞至濃度為 2X107~3X107 個/ml(OD50=1.0~1.3)。
2.離心收集細胞，并用冰預冷的水洗一次。
3.用冰預冷的 NP-40 緩沖液再洗一次后，轉移到 50 ml 的離心管中。
4.離心收集細胞，用 10 ml NP-40 緩沖液重新懸浮細胞。
5.向干冰預冷的研磨杵和臼中加入液氮。在液氮揮發時，逐滴往磨臼內加入細胞。并注意添加液氮以保持細胞的冷凍狀態。用力碾磨細胞 15 min。注意防止細胞的融化。
6.轉移處理好的裂解物到冰預冷的燒杯，并讓其在室溫中融化。當邊緣開始融化時，加人 20 ml 含有蛋白酶抑制劑的 NP-40 緩沖液（通常混合使用幾種商業化的蛋白酶抑制劑）。
7.轉移預處理好的裂解液到 40 ml 的 Nalgene 離心管中，用 SA-600 或類似型號的轉頭在 16500r/min 高速離心。
8.加入 1ml 瓊脂糖 6B(Sigma) 的珠子（與 NP-40 緩沖液按 1:1 混合）。4°C 旋轉搖動 30 mm。離心收集珠子。轉移上清液到一個新的 50 mlFalcon 離心管。
9.加入 400ul 用 NP-40 緩沖液預洗過的瓊脂糖 6Fast Flow IgG(Amersham)，并在 4°C 旋轉搖動至少 2 h。
10.旋轉搖動好的產物倒人 Poly-Prep(BioRad) 層析柱。自然重力壓緊。
11.30 ml NP-40 緩沖液洗柱子一次。
12.10 ml TEVC 緩沖液再洗一次。
13.將層析柱裝回收集管中，加人 lmlTEVC 緩沖液和 5 叫 TEV(tobaccoetchvirus) 蛋白酶。擰緊蓋后，4°C 旋轉搖動 2 h 至過夜。
14.吸取洗脫液并轉移到一個封住底部的新層析柱中。
15.1.0 ml TEVC 緩沖液洗舊層析柱。
16.加 3 ml CBB(鈣調蛋白結合緩沖液）到 TEV 上清液中，再在每毫升 TEV 洗脫液中加人 3ul 1 mol/L CaCl2。加 300jul 雀丐調蛋白結合珠子（Amersham) 于 CBB 中，珠子與緩沖液 1:1 混合后，4°C 平搖孵育 lh。
17.洗滌：
A.1ml CBB(0.1%NP-40) 洗 2 次
B.1ml CBB(0.02%NP-40) 洗 1 次
18.堵住層析柱底部，加入 1ml CEB(鈣調蛋白洗脫緩沖液)。
19.收集第一部分 1ml 洗脫液到微量離心管中。
20.堵住層析柱底部，加人 lmlCEB。
21.收集第二部分 lml 洗脫液到微量離心管中。
22.合并兩次收集液，分裝成 50(VU750|ul，750/zl 三份到未硅化的微量離心管中。
23.用 100%TCA 溶液配制 25%TCA，冰浴 30 mm，間或振蕩。
24.用最大轉速（13000r/min),4°C 離心 30 min。
25.用冰冷（一 20°C) 丙酮（含 0.05mol/L HCl) 洗一次后，在 4°C 下，最大轉速離心、5 min。
26.用冰冷（一 20°C) 丙酮洗一次后，在 4°C 下，最大轉速離心 5 min。
27.除去上清，真空干燥約 lOmin。
用 500ul 部分做 10% 的膠電泳銀染。用 750ul 部分做質譜分析。
展 |
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