①1倍沖洗液的制備 稀釋20mL 25倍沖洗濃縮液于480mLH2O中。
②對照抗原 加2mL 無菌 H2O 于陰性對照瓶中,加1mL 無菌 H2O 于陽性對照瓶中混勻。加水復原的抗原在2~8℃貯存可穩定60天。
從箔袋中取出所需數量的小孔(每個食品樣品1個孔和3個對照孔)。將小孔固定在條板托中。移取0.1mL經加熱處理過的 MN 肉湯樣品放入單獨的孔中。移取0.1mL 陰性對照液,放入2個小孔中;移取0.1mL 陽性對照液,放入1個小孔中。
用條板密封紙將板封上,于37℃培養30min。
培養后,從每個孔中吸出內容物并加0.2~0.3mL 1倍沖洗液于每一小孔中,重復此步驟2次。吸出最后的沖洗液。如果用自動沖洗器而平板沒有填滿,用沒有包被的小孔填充空位。
吸移0.1mL 酶接合劑于每一孔中,封板,于37℃培養30min。
吸出并用0.2~0.3mL 1倍沖洗液沖洗每孔6次,吸出最后的沖洗液前,在玻璃試管中等量混合 TMB 溶液 A 和 TMB 溶液 B。吸移0.1mL TMB 酶底物于每一小孔中,于室溫(20~25℃)培養30min 加0.1mL 終止液于每一小孔中。按(7)在10~15min 內讀條板。(7)讀數在讀數器上選用450nm 波長。以空氣做零點(無條板托盤和條板)讀取每一孔中溶液的吸收值 A,計算陰性對照孔 A 的平均值(應為<0.30),陽性對照的 A 必須為0.70。對照的 A 必須在此范圍內,檢測則有效。用陰性對照 A 的平均值加0.25計算臨界值。若樣品 A 大于或等于臨界值則推定為陽性,若樣品 A 小于臨界值則推定為陰性。(8)EIA 陽性樣品的確認 EIA 讀數陽性則表明可能存有沙門氏菌。由于抗體可與少數其他細菌交叉反應,故應按傳統檢驗方法從四硫磺酸鹽肉湯,亞硒酸鹽胱氨酸肉湯和混合的MN 肉湯管中蘸取培養物在 Hektoen 腸道(HE),木糖賴氨酸去氧膽酸(XLD)和亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板上劃線分離進行養物的確證。典型或可疑菌落必須按傳統培養方法進行生化和血清學鑒定。