酶切反應注意事項

一、 建立一個標準的酶切反應

目前大多數研究者遵循一條規則，即10個單位的內切酶可以切割1μg不同來源和純度的DNA。通常，一個50μl的反應體系中，1μl的酶在1X NEBuffer終濃度及相應溫度條件下反應1小時即可降解1μg已純化好的DNA。如果加入更多的酶，則可相應縮短反應時間；如果減少酶的用量，對許多酶來說，相應延長反應時間（不超過16小時）也可完全反應。

二、 選擇正確的酶

不言而喻，選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個相應的識別位點。識別堿基數目少的酶比堿基數目多的酶更頻繁地切割底物。假設一個GC含量50%的DNA鏈，一個識別4個堿基的酶將平均在每44（256）個堿基中切割一次；而一個識別6個堿基的酶將平均在每46（4096）堿基切割一次。內切酶的產物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。粘端產物可以與相容的其它內切酶產物連接，而所有的平端產物都可以互相連接。相關信息參見目錄的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。

三、 酶

內切酶一旦拿出冰箱后應當立即置于冰上。酶應當是最后一個被加入到反應體系中（在加入酶之前所有的其它反應物都應當已經加好并已預混合）。酶的用量視在底物上的切割頻率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超過1U/μg的酶才能被完全切割。參見目錄第244和264之"切割質粒DNA"和"包埋法切割DNA"。

四、 DNA

待切割的DNA應當已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應該是酶切要考慮到的因素。關于甲基化的內容，參見第252頁至253頁之甲基化相關內容。