酶切后的質粒和基因組DNA有何不同

分離質粒時,可以將質粒去得很干凈.
方法為：先用TE之類的試劑將菌液懸浮起來,再用NaOH和SDS將菌液裂解（起裂解作用的主要是NaOH,但此時,SDS可以與蛋白很好的結合）.第三步,加入酸中合第二步中的堿,并且將SDS沉淀下來,同時,SDS和蛋白也一起沉淀下來,而基因組上面有很多的蛋白,這樣基因組就一起沉淀下來,上清只有質粒了.上清的質粒用乙醇沉淀,這樣得到的質粒基本沒有基因組.
而分離基因組時,一般也是用SDS裂解（想對于堿裂解,SDS比較溫和）.同時還用蛋白酶K處理,將基因組上的蛋白降解掉,這樣就得到了基因組DNA.再用乙醇沉淀,去掉其他的東東.如果菌中含有質粒,質粒也一起提出來,無法去掉.
至于后來的試劑盒,如柱式,前其原理一樣,不過最后一步純度是用柱子的方
重組質粒的構建需要對DNA分子進行切割，并連接到合適的載體上進行體外重組。限制性核酸內切酶和DNA連接酶的發現與應用，為重組質粒的構建提供了有力的工具。
限制性核酸內切酶酶切分離法適于從簡單基因組中分離目的基因。質粒和病毒等DNA分子小的只有幾千堿基，大的也不超過幾十萬堿基，編碼的基因較少，獲得目的基因的方法也比較簡單。
DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA 連接酶：T4 DNA連接酶。T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：1、連接具有同源互補粘性末端的DNA片段；2、連接雙鏈DNA分子間的平端；3、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。
目的DNA片段與載體DNA片段之間的連接方式（以T4DNA連接酶為例）主要有以下幾種：
（一）、具互補粘性末端片段之間的連接
大多數的核酸內切限制酶都能夠根據識別位點切割DNA分子，形成1~4核苷酸單鏈的粘性末端。當載體和外源DNA用同一種限制性內切酶切割時，產生相同的粘性末端，連接后仍保留原限制性內切酶的識別序列；如果用兩種能夠產生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割時，雖然可以有效地進行連接，但是獲得的重組DNA分子消失了原來用于切割的那兩種限制性核酸內切酶的識別序列，這樣不利于從重組子上完整地將插入片段重新切割下來。
（二）、平末端的連接
載體分子和外源DNA插入片段并不一定總能產生出互補的粘性末端。實際上有許多情況都是例外的，因為有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的實驗要用兩種不同的限制酶分別切割載體分子和外源DNA，形成的也多半是非互補的粘性末端或平末端；再如用機械切割法制備的DNA片段，PCR擴增的和化學合成的DNA片段或由RNA為模板反轉錄合成的cDNA片段，也不會具有互補的粘性末端。
理論上任何一對DNA平末端均能在T4DNA連接酶催化下進行連接，這給不同DNA分子的連接帶來了方便。但是，平末端連接更為復雜，且速度也慢得多，因為一個平末端的5’磷酸基團或3’羥基與另一個平末端的3’羥基和5’磷酸基團同時相遇的機會顯著減少，通常平末端的連接速度為粘性末端的1/10~1/100。為了提高其反應活性，一般選擇16℃較為合適。
外源目的基因與載體在體外連接重組后形成重組DNA分子，重組DNA分子必須導入適宜的受體細胞中方能使外源目的基因得以大量擴增或表達。隨著基因工程的發展，從低等的原核細胞，到真核細胞，進一步到結構復雜的高等動、植物細胞都可以作為基因工程的受體細胞。選擇適宜的受體細胞已成為重組基因高效克隆或表達的基本前提之一。
所謂受體細胞（receptor cell）又稱為宿主細胞或寄主細胞（host cell）等，從實驗技術上講是能攝取外源DNA并使其穩定維持的細胞；從實驗目的上講是有應用價值和理論研究價值的細胞。顯然，并不是所有的細胞都可用作受體細胞。一般情況下，受體細胞的選擇應符合以下基本原則：
（1）便于重組DNA分子的導入；（2）能使重組DNA分子穩定存在于細胞中；（3）便于重組體的篩選；（4）遺傳穩定性高，易于擴大培養或發酵生長；（5）安全性高，無致病性，不會對外界環境造成生物污染；（6）選用內源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細胞，利于外源基因蛋白表達產物在胞內的積累，或促進外源基因的高效分泌表達；（7）受體細胞在遺傳密碼的應用上無明顯偏倚性；（8）具有較好的轉譯后加工機制，便于真核目的基因的高效表達；（9）在理論研究和生產實踐上有較高的應用價值。以上是受體細胞選擇的總原則，在實際應用過程中，可根據具體需要或用途而重點考慮其中部分要求即可。
原核生物細胞: 是較為理想的受體細胞類型，其原因是：
（1）大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA進入；（2）沒有核膜，染色體DNA沒有固定結合的蛋白質，為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩；（3）基因組簡單，不含線粒體和質體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析；（4）原核生物多數為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。
鑒于上述原因，原核生物細胞普遍作為受體細胞用來構建基因組文庫和cDNA文庫，或者用來建立生產目的基因產物的工程菌，或者作為克隆載體的宿主菌。至今被用作受體菌的原核生物有大腸桿菌、枯草桿菌等。大腸桿菌是迄今為止研究得最為詳盡、應用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應用中發展最為完善和成熟的載體受體系統。
體外連接的DNA重組分子導入合適的受體細胞才能大量地進行復制、增殖和表達，將外源重組體分子導入受體細胞的途徑，包括轉化（或轉染）、轉導、顯微注射和電穿孔等多種不同的方式。本實驗以大腸桿菌為受體的基因轉移。
轉化方法：重組質粒DNA分子通過與膜蛋白結合進入受體細胞，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程稱之為轉化（transformation）。細菌轉化的本質是受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，即轉化因子，并在細胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應遺傳性狀的過程。
以革蘭氏陽性細菌為例，細菌轉化的一種可能機制包括如下基本步驟：
（1）細菌感受態的形成；（2）轉化因子的吸收；（3）整合復合物前體的形成；（4）單鏈DNA轉化因子的整合；（5）轉化子的形成。
大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，其細胞表面的結構和組成均與革蘭氏陽性細菌有所不同，自然條件下很難進行轉化，其主要原因是轉化因子的吸收較為困難，尤其是那些與其親緣關系較遠的DNA分子更是如此。因此在大腸桿菌的重組質粒DNA分子的轉化實驗中，很少采取自然轉化的方法，通常的做法是采用人工的方法制備感受態細胞，然后進行轉化處理，其中代表方法之一是Ca2誘導的大腸桿菌轉化法。
Ca2誘導的轉化：細菌處于容易吸收外源DNA狀態叫感受態，用理化方法誘導細胞進入感受態的操作叫致敏過程。重組DNA轉化細菌的技術操作關鍵就是通過化學方法，人工誘導細菌細胞進入一個敏感的感受態，以便外源DNA進入細菌內。其原理是將處于對數生長期的細菌置于0℃，CaCL2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，同時Ca2 使細胞膜磷脂層形成液晶結構，使得位于外膜與內膜間隙中的部分核酸酶離開所在區域，這就構成了大腸桿菌人工誘導的感受態。此時加入DNA，Ca2 又與DNA結合形成抗脫氧核糖核酸酶（Dnase）的羥基-磷酸鈣復合物，并粘附在細菌細胞膜的外表面上。經短暫的42℃熱脈沖處理后，細菌細胞膜的液晶結構發生劇烈擾動，隨之出現許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機進入細胞內。 Ca2處理的感受態細胞，一般每微克DNA能獲得105～106個轉化子，環化重組子分子愈小，轉化率愈高，環狀DNA分子比線性DNA分子的轉化率高1000倍。
轉化子的篩選以及鑒定：在重組DNA分子的轉化、轉染或轉導過程中，并非所有的受體細胞都能被導入重組DNA分子，一般僅有少數重組DNA分子能進入受體細胞，同時也只有極少數的受體細胞在吸納重組DNA分子之后能良好增殖。并且它們是與其他大量未被轉化的受體菌細胞混雜在一起。再者，在這些被轉化的受體細胞中，除部分含有我們所期待的重組DNA分子外，另外一些還可能是由于載體自身或一個載體與多個外源DNA片段形成非期待重組DNA分子導入所致。因此，如何將被 轉化細胞從大量受體菌細胞中初步篩選出來，然后進一步檢測到含有期待重組 DNA分子的克隆子將直接關系到基因克隆和表達的效果，也是基因克隆和工程操作中極為重要的環節。
通常我們將導入外源DNA分子后能穩定存在的受體細胞稱為轉化子，而含有重組DNA分子的轉化子被稱為重組子，如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽性克隆子或期望重組子。
在構建基因工程載體系統時，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標記基因，轉化或轉染宿主細胞后可以使后者呈現出特殊的表型或遺傳學特性，據此可進行轉化子或重組子的初步篩選。一般的做法是將轉化處理后的菌液（包括對照處理）適量涂布在選擇培養基上，在最適生長溫度條件下培養一定時間，觀察菌落生長情況，即可挑選出轉化子。
選擇培養基是根據宿主細胞類型配置的培養基，對于細菌受體細胞而言，通常用LB培養基，在LB培養基中加入適量的某種選擇物，即為選擇培養基。選擇物是由載體DNA分子上攜帶的選擇標記基因所決定，一般與標記基因的遺傳表型相對應，主要有抗菌素和顯色劑等，相應的篩選（選擇）方法包括抗藥性篩選、插入失活篩選和顯色互補篩選等。
在本實驗中利用的是麥康凱培養基，用來篩選重組子。質粒PUC19進入E.coliDH5α后，通過α-互補作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麥康凱培養基的平板上，轉化子利用β-半乳糖苷酶分解培養基中的乳糖產生有機酸，PH降低培養基中的指示劑變紅，轉化子的菌落變成紅色。而含有外源基因片段的PUC質粒進入受體細胞后，不能形成互補的β-半乳糖苷酶活性而出現白色菌落，這樣根據這個條件即可篩選重組子。
實驗材料以及儀器
PUC19的質粒、LB培養基、麥康凱培養基 提取質粒試劑盒
恒溫振蕩培養箱，高速離心機，旋渦振蕩器，水浴鍋，酒精燈，微波爐，天平，電子天平，分析天平，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，量筒，移液槍，冰盒，槍尖，Eppendorf管，塑料薄膜，微量移液器，手套，記號筆。
LB培養基，抗生素氨芐青霉素(50ug/L)，TAE電泳緩沖液(10×)，瓊脂糖，50×TAE緩沖液，溴化乙錠(EB)， DNA相對分子質量標準物DNA Marker k／HindⅢ
實驗步驟
1 準備階段
1.1 培養基的制備 LB培養基 麥康凱培養基
1.2 槍尖的準備 1000 ul、200 ul、20 ul的槍尖在槍尖盒內裝好，貼上標簽
1.3 EP管的準備 在三角瓶內裝好，不要裝得太滿
1.4 準備好之后集體滅菌，備用
2 實驗階段
2.1 酶切
2.1.1 Puc19的質粒DNA酶切體系：8.7 uldd H2O 、4 ul PUC19質粒DNA、1.5 ul 10×Buffer 、0.8 ul HindⅢ。
2.1.2 按上述的順序將酶切體系加好，混勻，置于37℃的水浴鍋內2h。
2.2 制備感受態細胞（無菌條件）
2.2.1 將事先已經培養好的OD值為0.5左右的大腸桿菌的菌懸液置于冰上，備用；
2.2.2 取出三個EP管，在酒精燈上將菌懸液加到三個管中，每管1.5ml；
2.2.3 之后再離心，5000rmp×5min,離心之后將上清液倒掉（在酒精燈下）
2.2.4 之后再在每管中加入1.5ml的菌懸液，離心，倒掉上清液；
2.2.5 加入800 ul的CaCl2混勻，之后冰浴5min；
2.2.6 離心5000rmp×5min，倒掉上清；
2.2.7 加入100 ul的CaCl2，混勻即可，之后放置在-4℃冰箱中備用，或者在冰盒中。
2.3 麥康凱培養（無菌條件）
2.3.1 將已經滅好菌的液體麥康凱培養基放置在室溫下；
2.3.2 在大約培養基的溫度與手背的溫度差不多時，加入ul的氨芐青霉素（先預熱再將氨芐青霉素打入培養基中）；
2.3.3 倒平板，大約每個平板20ml；
2.4 連接
2.4.1 連接體系：9 ul的dd H2O、3ul的digested PUC19DNA、5ul的digestedλ噬菌體的DNA、2ul的10×Buffer、1ul的T4連接酶。
2.4.2 按照上述順序依次加入，混勻，16℃的水浴鍋，連接過夜。
2.5 轉化
2.5.1 在三管感受態細胞中分別加入5ul連接液、0.5ul的puc19質粒、空白；
2.5.2 混合均勻，42℃熱擊90s（時間要準確計時）；
2.5.3 之后置于冰上，再在每管中加入600ul的新鮮的LB培養基；
2.5.4 搖床震蕩培養1h。
2.6 涂布
2.6.1 按照以下的表格中顯示的涂平板（無菌條件）
2.6.2 在平板上做好標記，之后在37℃下培養。

含量
類型

20ul

50ul

100ul

200ul

含有連接液（Amp）

1個
（+）

2個
（++）

2個
（+++）

1個
（+++++）

含puc19質粒(Amp)

1個
（-）

空白(Amp)

1個（-）

不含Amp的平板

1個（+++）

涂布驗證表格（“+”表示紅色菌落的多少，“—”表示沒有紅色菌落）
2.7 涂布觀察
2.7.1 觀察平板上菌落的生長情況：
2.7.2 記錄情況如上，其中不含Amp的平板上培養基變黃；
2.7.3 在含有Amp的平板上涂有連接液的平板上可以看到白色的菌落，這就是我們所需要的連接上的重組子形成的菌落，挑選紅色菌落中的單獨的白色菌落進行劃線培養；
2.7.4 用牙簽輕輕挑去白色菌在含有氨芐青霉素的麥康凱培養基上劃線，盡量將平板合理利用，不要將培養基劃破；
2.7.5 做好標記，繼續培養。
2.8 驗證
2.8.1 用接種環挑取平板上單獨的大的白色菌落在液體培養基中（菌落的選擇一定要適當，這對于后面的驗證很重要）；
2.8.2 挑取兩管菌液，做好標記，37℃振蕩培養過夜；
2.8.3 用試劑盒提取質粒：
2.8.3.1 在兩個EP管中各加1.5ml的菌液，10000rmp×1min，之后倒去上清， 在各加1.5ml菌液離心（兩管菌液不要混用，可以看做兩種質粒）；
2.8.3.2 吸取上清后，加入250微升的溶液Ⅰ，充分振蕩混勻，使細胞懸浮；
2.8.3.3 加入25微升溶液Ⅱ，請求那個翻轉倒置數次，直到獲得透明的裂解液；
2.8.3.4 加入350微升的溶液Ⅲ，立即翻轉倒置數次至有絮狀沉生成；
2.8.3.5 之后離心，10000rmp×10min，吸取上清于離心柱中，離心10000rmp×1min，棄收集管中的液體；
2.8.3.6 在離心柱中加500微升的BufferHB，離心10000rmp×1min，棄收集管中的收集液；
2.8.3.7 在離心柱中加入700微升的Wash Buffer，離心10000rmp×1min，棄收集管中的收集液；
2.8.3.8 空離心柱再離心13000rmp×2min；
2.8.3.9 將離心柱取出置于1.5ml的EP管中，加入40微升的Elution Buffer,將液體加在離心柱的孔中，靜置2min,之后離心13000rmp×1min;
2.8.3.10 將離心柱取出，將EP管中的質粒DNA放好，做好標記；
2.8.4 重組質粒DNA 的酶切
2.8.4.1 重組質粒DNA的酶切體系：4.5 ul的dd H2O，4ul的重組質粒DNA，1.0ul的Buffer，0.5ul的HindⅢ；
2.8.4.2 按照上述的順序，一次加入，混合均勻，置于37℃的水浴鍋內1h;
2.8.5 電泳
2.8.5.1 在所得的酶切液中加入3微升的Loating Buffer,混合均勻點在膠孔中，點上相應的HindⅢ的marker；
2.8.5.2 在EB中染色10min左右在紫外燈下觀看實驗現象，分析條帶；
實驗結果

1 2 3
重組質粒DNA酶切電泳圖
結果分析：
在上圖中自左向右第七泳道即為marker帶，分為多條帶，在marker的右側的兩個帶即為我們組所提取的質粒DNA 的酶切帶：其中1為所連的目的基因，大約是2.0kb左右的大小，2為載體，條帶的大小大約為2.8kb，3為所連的目的基因，條帶的大小大約為6.5kb大小。
這兩種質粒酶切之后的結果相同，說明連接的目的基因是相同的，至少在大小上是相同的。由于是單酶切，所以重組質粒連上的不一定是單片段，可能是單片段單拷貝、單片段多拷貝或是多片段插入等。
一般來說較大的片段不易完成連接和轉化。在連接方面，載體和片段沒有足夠的完整接觸的機會，且連接上的大片段對整個重組載體的生長狀態會有比較大的影響，同時，大質粒的轉化相對比小質粒效率低一些，這個在圖中就可以看到，幾乎沒有較大的片段，主要集中在載體附近。
注意事項
1.限制性核酸內切酶的酶切反應應屬于微量操作技術，無論是DNA樣品還是酶的用量都很少，必須嚴格注意吸樣量的準確性并確保樣品和酶全部加入反應體系。
2.注意酶切加樣的次序，一般先加重蒸水，其次加緩沖液和DNA，最后加酶。前幾步要把樣品加到管底的側壁上，加完后用力將其甩到管底，而酶液要在加入前從-20℃冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液時洗頭應從表面吸取，防止由于插入過深而使吸頭外壁沾染過多的酶液，取出的酶液應立即加入反應混合也得液面以下，并充分混勻。酶液使用完畢后立即放回冰箱，防止酶的失活。
3.注意蓋緊Eppendorf管的蓋子，防止水浴加熱的過程中水汽進入管內，并注意做好標標記以防樣品混淆。
4.為了提高連接效率，一般采取提高DNA的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現DNA自生連接問題，為此通常選擇對質粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其5’末端的磷酸基，防止環化，通過接反應后的卻口可在轉化細胞后得以修復。
5.勿將含有DNA的凝膠長時間暴露在紫外燈下，減少紫外線對DNA造成的損傷。要回收DNA時，盡可能采用長波長的紫外燈(300～360 rim)。切膠時，紫外照射時間應盡量短，以免對DNA造成損傷。
6.涂布時先將涂布棒蘸取酒精，再在酒精燈火焰上燒三遍，燒時酒精會引燃，注意安全。
7.為了節省涂布時間，可以先涂第一組的不含氨芐的，然后是含有氨芐的，然后是第二組，這四塊平板可以一塊涂。第三組的可以一塊涂，但是要注意從低濃度到高濃度涂布。
8.涂布時，一定要等培養基凝固完全后再涂。
9.酶切、連接及轉化等涉及微生物部分的實驗要注意無菌操作，涉及分子實驗的部分雖然不用無菌，但要注意不要污染雜質。
實驗小結
質粒的酶切、連接、轉化、重組子的篩選及質粒的提取等操作通過一系列實驗有了進一步的了解。學會了分析瓊脂糖凝膠電泳所反應出來的信息，如看片段大小、連接結果的分析等。
通過這次一系列的實驗，熟悉分子實驗的基本操作技術，在平時的學習中學到的很多分子生物學和基因工程的知識都得到了應用，這些操作中的注意事項都有了了解。現在，經過學習，最有收獲的就是相信等做完了后面的實驗，自己就可以進行一系列簡單的分子實驗了。