酶反應動力學主要研究酶催化反應的過程與速率，以及各種影響酶催化速率的因素，定量時的觀察對象是總單位時間內底物的減少或產物增加的量。
影響酶作用的因素包括底物的濃度、酶反應的最適pH、最適溫度、酶的抑制作用，另外還包括試劑中表面活性劑的作用等因素。
1.底物濃度的影響
在檢測試劑中底物濃度、輔因子、活化劑、復構劑的種類和濃度均對酶的測定至關重要。其中以底物的種類和濃度最為重要。
底物濃度影響遵循米氏方程：
ν=V[S]/Km+[S]
當底物濃度遠遠小于Km ，增加底物濃度，反應速度增加。
當底物[S]＞＞Km 時，公式近似為ν=V，反應速度不再增加，故此時反應速度為最大反應V。
從理論上說只有測定的是酶最大反應V，反應速度才和酶量成正比。
(1)底物的種類
若所測的酶專一性不強，可作用于多種底物，Km 最小的底物往往是此酶的生理底物。 (Km表示酶和底物的親和力，Km越小親和力越大)
如該酶測定主要用于臨床診斷工作，首先應考慮有效診斷價值的底物。
選擇Km小的底物測定酶活性，在最大反應速度時底物濃度也將最低。這意味著試劑成本可能較低，不易出現底物難溶解的困難。
(2)選擇底物的合適濃度
確定底物種類后，重要的是選擇底物的合適濃度。
米氏方程在選擇酶測定底物濃度有著重要的指導作用。
計算出某一酶的Km后就可以計算出不同底物濃度和Km間的比值，將其代入米氏方程就可以計算出此時酶促反應速度相當于最大反應速度的百分比。
上述只能適應用于單一底物的酶。
2.反應體系的最適pH、緩沖液的種類和濃度
測定酶活性濃度時一定要選擇在最適pH。
因為此處酶反應速度最大，測定靈敏度最高。此處酶活性變化的斜率最小，如反應體系中出現pH變化時，對測定結果影響最小。
pH還可以影響酶的穩定性。
為使反應體系能穩定在最適pH范圍，實際檢測時多采用不同類型、不同濃度的緩沖液。
3.溫度的控制
溫度對酶活性影響具有雙重性。
化學速度隨溫度升高而加快，酶反應也不例外。
Q10值即溫度增加10℃，化學速度的變化率。酶的Q10值約在1.5～2.5。(溫度每增加10℃，酶促反應速度增加1～2倍左右。)
當溫度超過一定范圍，反應速度下降，(酶蛋白變性)應選最適反應溫度。
37℃是目前使用最廣泛的測定酶催化活性濃度的溫度。