在生物體內，酶發揮著非常廣泛的功能。信號轉導和細胞活動的調控都離不開酶，特別是激酶和磷酸酶的參與。酶也能產生運動，通過催化肌球蛋白上ATP的水解產生肌肉收縮，并且能夠作為細胞骨架的一部分參與運送胞內物質。一些位于細胞膜上的ATP酶作為離子泵參與主動運輸。一些生物體中比較奇特的功能也有酶的參與，例如熒光素酶可以為螢火蟲發光。病毒中也含有酶，或參與侵染細胞（如HIV整合酶和逆轉錄酶），或參與病毒顆粒從宿主細胞的釋放（如流感病毒的神經氨酸酶）。
復合酶的一個非常重要的功能是參與消化系統的工作。以蛋白酶為代表，可以將進入消化道的大分子（淀粉和蛋白質）降解為小于15微米的小分子，以便于腸道毛細血管充分吸收。淀粉不能被腸道直接吸收，而酶可以將淀粉水解為麥芽糖或更進一步水解為葡萄糖等腸道可以吸收的小分子。不同的酶分解不同的食物底物。在草食性反芻動物的消化系統中存在一些可以產生纖維素酶的細菌，纖維素酶可以分解植物細胞壁中的纖維素，從而提供可被吸收的養料。
在代謝途徑中，多個酶以特定的順序發揮功能：前一個酶的產物是后一個酶的底物；每個酶催化反應后，產物被傳遞到另一個酶。有些情況下，不同的酶可以平行地催化同一個反應，從而允許進行更為復雜的調控：比如一個酶可以以較低的活性持續地催化該反應，而另一個酶在被誘導后可以較高的活性進行催化。酶的存在確定了整個代謝按正確的途徑進行；而一旦沒有酶的存在，代謝既不能按所需步驟進行，也無法以足夠的速度完成合成以滿足細胞的需要。
實際上如果沒有酶，代謝途徑，如糖酵解，無法獨立進行。例如，葡萄糖可以直接與ATP反應使得其一個或多個碳原子被磷酸化；在沒有酶的催化時，這個反應進行得非常緩慢以致可以忽略；而一旦加入己糖激酶，在6位上的碳原子的磷酸化反應獲得極大加速，雖然其他碳原子的磷酸化反應也在緩慢進行，但在一段時間后檢測可以發現，絕大多數產物為葡萄糖-6-磷酸。于是每個細胞就可以通過這樣一套功能性酶來完成代謝途徑的整個反應網絡。