酶標儀利用”無創”技術檢測活細胞熒光蛋白（二）

下一步就是要結合信號/背景優化結果確定最佳激發和發射波長。因為初步檢測結果的斯托克頓位移偏小(22nm)，顯然是要通過降低激發波長和增大發射波長來擴大兩者之間的差異，其次還需要找到合適的發射光阻隔濾片優化最佳靈敏度。最終，我們使用5 5 0nm的激發波長來激發， 同時使用570nm的發射光阻隔濾片隔離掉不想要的高于570nm以上的激發光。通過575到600nm的發射波長掃描DsRed轉染的細胞，結果顯示在587-588nm處會有峰值出現(圖3，上面的曲線)。背景(沒有轉染的細胞)區域中，點就相對比較平緩(圖3，下面的曲線)。基于本次掃描，我們最終優化的設置為550nm激發、588nm發射、575nm作為發射光阻隔濾片。

觀察到的最大值與我們建議用于定性分析的設置都總結在列表1中。

 

 

細胞稀釋的結果

采用底讀得到的細胞稀釋結果詳見圖4(96孔板)和圖5(384孔板)。頂讀結果詳見圖6(96孔板)和圖7(384孔板)。ZsGreen細胞系(上面的曲線)的亮度是其它兩種細胞系的將近3.5倍。盡管DsRed細胞系的結果暗于ZsGreen，但兩種細胞系的檢測靈敏度卻相近。(列表2的下圖)，因為背景值低于DsRed的波長。

 

總的來說，圖中的點稍微有些非線性，最上方會有一點下降。我們推斷是因為細胞在高濃度時，會有貼壁生長的趨勢，所以會造成非線性的結果。列表2給出了所有細胞系確認得到的檢測下限L L D 。其中L L D 的計算方法是：3SDBLANK/Slope，SDBLANK是背景孔(沒有細胞的培養基)的標準差，Slope是曲線底部的斜率。(對于96孔板和384孔板，分別使用了10,000個細胞每孔和2500個細胞每孔的數據)。非轉染細胞的RFU信號和標準差結果都與只含有培養基的結果相似。