酶標儀在植物領域的三種應用總結（一）

一、簡介 

在基于哺乳動物細胞的研究中，酶標儀主要應用于: (1) 常規分子檢測，如核酸、蛋白濃度及酶活性分析等；(2) 信號轉導研究， 如一些細胞信號事件如 ROS，修飾的檢測；(3) 整體細胞水平的分析，如細胞的活力、凋亡和殺傷等。然而在植物領域中，酶標 儀的應用則偏向前兩個方向，此外，植物領域的酶標儀應用普遍度也不及動物，但這并不限制酶標儀在該領域的應用前景。在此， 我們結合常見的應用案例介紹酶標儀在植物領域中的應用，提升酶標儀在植物研究中的應用價值，并進一步協助植物的科研發展。 

二、利用酶標儀進行常見的分子檢測和分析 

在植物領域中一些基礎的分子檢測，如基于紫外吸收或熒光的 DNA，RNA 和蛋白定量及純度分析等，都可以用酶標儀進行 高通量檢測。由于原理和應用類型與研究哺乳動物細胞類似，在此就不贅述了，大家有需求可參考我們針對核酸定量的應用材料。 在此我們主要列植物領域中比較特色的幾個案例。 

2.1 吸收峰和熒光光譜分析 

植物領域中通常會涉及到對一些感興趣的化合物，如色素等的物理指標分析，其中就包括吸收峰分析和針對具有熒光特質的 化合物進行熒光光譜分析。通常這些分析會由分光光度計完成，但會受到通量和曲線分析能力的限制。現階段大部分 Molecular Devices 推出的配備光柵的酶標儀如 M 系列和 iD 系列都支持出色的光譜掃描分析，包括全波長光吸收和熒光光譜掃描，步進可精 確至 1 nm，可應對常見的光譜分析需求，并極大提高通量。同時配備的 SoftMax Pro 軟件可自動分析光譜圖簡化處理流程。

基于光譜掃描還可用于進一步分析具有調節熒光能力的蛋白功能，如藍藻細菌中的 Orange Carotenoid Protein (OCP) 在強 藍-綠光下會和藻膽 ( 蛋白 ) 體 (PBS) 相互作用來保護細胞。實驗中可觀察到 OCP 的引入可降低 PBS 的熒光發射強度。對于新發現 的 OCP 家族成員，我們就可以通過熒光光譜掃描功能確認其是否會淬滅 PBS 的熒光 ( 圖一 )。結果發現相較于已知的 OCP1，新 發現的 OCP2 具有較弱的熒光淬滅能力 ( 圖一，來源于文獻 Nat Plants. 2017 Jul 10;3:17089. )。

^{圖一 分析 OCP 的 PBS 熒光淬滅能力，黑色實線代表無強藍-綠光照射下 PBS 的熒光發射譜 ( 激發 580 nm )，黑色虛線代 表在強藍-綠光照射下 PBS 的熒光發射譜。藍色和紅色虛線分別代表在在強藍-綠光引入 OCP1 和 OCP2 。 圖片來源于文獻：Nat Plants. 2017 Jul 10;3:17089.。酶標儀為 SpectraMax M2。}

2.2 酶活分析

在植物研究中，酶活分析也是常見的檢測之一，主要用于探究植物本身酶的功能和植物提取物對各種酶活性的影響。基于底 物工作機制的不同，酶活可用光吸收法和熒光法檢測。例如圖二就展示了多種植物的提取物對參與血糖調控的 α-淀粉酶 (α-amylase) 和 α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase) 活力的抑制 ( 來源于文獻：J Agric Food Chem. 2012 Sep 12;60(36):8924-9.)。其中，α-淀粉酶 的活力檢測是基于使用自身淬滅的 DQ? starch 熒光底物。隨著底物在酶的作用下發生降解，進而發出熒光，并可通過熒光強度 的變化分析酶活。而 α-葡萄糖苷酶活性的檢測則基于其底物光吸收屬性在酶處理下的變化。

^{圖二 不同濃度植物提取物對 α-淀粉酶 ( 左 ) 和 α-葡萄糖苷酶 ( 右 ) 活力的抑制。圖片來源于文獻：J Agric Food Chem. 2012 Sep 12;60(36):8924-9.。酶標儀為 SpectraMax Gemini ( 熒光檢測 ) 和 SpectraMax 190 ( 光吸收檢測 )}

通常，酶活檢測基于動力學檢測模式，同時需要進行控溫。多數 Molecular Devices 推出的酶標儀均可完成酶活檢測。除此 之外，配備的 SoftMax Pro 軟件支持工作流，可進行復雜的酶活設定和檢測，同時對動力學的多種分析，如斜率，最高速度，曲 線下面積等，都可輕松用軟件批量分析。

2.3 DPPH 和 ORAC 分析

DPPH 和 ORAC 分析是抗氧化研究中常見的兩個檢測項目，常被用于分析植物和中藥提取物的抗氧化能力。其中 DPPH ( 1,1二苯基-2-三硝基苯肼 )自由基清除實驗基于帶有自由基的 DPPH 和中和后的 DPPH 具有不同的光吸收屬性進行分析待測物質是否 具有自由基清除能力 ( 圖三 )。

^{圖三 DPPH 工作原理，圖片來源于網址：https://www.omicsonline.org/articles-images/2161-0444-4-517-g001.html}

因此，配備光吸收功能的酶標儀就可用于檢測 517 nm 附近的吸收強度變化，進而推測待測樣本的自由基清除能力。圖四展 示了不同的類胡蘿卜素的抗氧化能力比較 (Sci Rep. 2016 Feb 23;6:21987.)。

^{圖四 基于 DPPH 自由基清除實驗比較不同類胡蘿卜素的抗氧化能力， 圖片來源于文獻：Sci Rep. 2016 Feb 23;6:21987.。酶標儀為 SpectraMax Plus384。}

ORAC 實驗則是檢測氧化自由基吸收能力 (Oxygen Radical Absorbance Capacity)，與 DPPH 不同，其基于熒光法。體系中 引入的自由基產生者 AAPH (2,2’-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride) 會破壞熒光探針，使熒光強度逐漸衰退。而引 入的具有抗氧化能力的待測樣本則會抑制熒光強度的衰退，進而通過計算熒光動態曲線的曲線下面積 (AUC) 的變化可分析待測化 合物的抗氧化能力 ( 圖五 )。一般，ORAC 實驗中會用 Trolox 標準品作為校準，獲得不同待測樣本的抗氧化指數 ( 圖五， Molecules. 2013 Oct 17;18(10):12937-50. )。

^{圖五 利用 ORAC 實驗分析不同草藥提取物的抗氧化能力。左圖為熒光動力學曲線，可觀察到草藥提取物的引入增加 了熒光探針的信號壽命 ( 曲線下面積 )。右圖為參考 Trolox 結果得出抗氧化指數。圖片來源于文獻：Molecules. 2013 Oct 17;18(10):12937-50.。酶標儀為 SpectraMax Gemini}