基本方案1 非特異酸性磷酸酶消化磷酸蛋白質
基本方案2 絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶消化磷酸蛋白質
| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | 含 100～200 μg 總蛋白的樣品 |
| 試劑、試劑盒 | 50 mmol L N N'-2-羥丙磺酸哌嗉(PIPES) Sephadex G-25 柱（可選） PIPES 2－ME 或 RPERS DTT 緩沖液 馬鈴薯酸性磷酸酶 2 × SDS－PAGE 樣品緩沖液 100 mmol L 焦磷酸鈉 |
| 儀器、耗材 | 90℃ 水浴或加熱塊 |
| 實驗步驟 | 1. 制備含 100～200 μg 總蛋白的樣品。通過透析或脫鹽除去抑制性的代謝產物，或用 2 或 3 倍體積 50 mmol/L PIPES 緩沖液 pH 6.0，洗滌除去微粒物質。 2. 樣品在 100 μl PIPES/2－ME 或 PIPES /DDT 緩沖液，pH 6.0 中 30℃ 溫育 10 min。 3. 加入 5～10 U 馬鈴薯酸性磷酸酶，30℃ 溫育 15 min。 4. 取出 10 μl 樣品加入等體積 2 × SDS 樣品緩沖液。90℃ 加熱 5 min。 5. 在 SDS 聚丙烯酰胺凝膠中電泳脫磷酸樣品。放射標記的樣品通過放射自顯影或磷成像分析底物蛋白放射標記物的丟失；非標記樣品通過免疫印潰分析底物遷移率的變動。 6. 剩余的樣品加入 10 μl 的 100 mmol/L 焦磷酸鈉（終濃度 10 mmol/L）以終止脫磷酸反應。通過適當的蛋白質功能分析方法分析底物脫磷酸化的變化。 |