影響酶活性的因素包括底物的濃度、酶濃度、酶反應的最適pH、最適溫度、酶的激活劑、抑制作用，另外還包括試劑中表面活性劑的作用等因素。
1.反應速度：大多數酶促反應是可逆反應，其速度既受底物濃度的影響，也受產物生成量的影響。酶反應動力學中所指速度是反應的初速度。
當底物濃度較高時，在反應的初期，其濃度變化甚微，產物生成量也很少，此時反應速度可看作是恒定的。
2.底物濃度：
米氏方程是反映酶促反應速度與底物濃度關系
[S]：底物濃度。
ν：不同[S]時的反應速度。
νmax：最大反應速度。
Km：米氏常數。
Km等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度。
Km值是酶的特征常數之一，只與酶的性質有關，而與酶濃度無關。
不同的酶，Km值不同。同一個酶有幾種底物時，則對每一種底物各有一特定的Km值，其中Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物。
3.測定酶活力時需注意
（1）酶促反應過程中，要用初速度表示酶促反應速度。
（2）要規定時間、溫度、pH等反應條件，并在酶測定過程中保持這些反應條件的恒定。
（3）配制的底物濃度應準確且足夠大，底物液中應加入不抑制該酶活力的防腐劑并保存于冰箱中，以防止底物被分解。
（4）標本要新鮮，應保存于冰箱中。用血漿時，應考慮到抗凝劑對酶反應的影響。在采血、分離血清時，應注意防止溶血和白細胞的破裂。
（5）在測定過程中，所用儀器應絕對清潔，不應含有酶的抑制物，如酸、堿及蛋白沉淀劑等。