常用的測定方法有取樣法和連續法。
取樣法是在酶反應開始后不同的時間，從反應系統中取出一定量的反應液，并用適當方法停止其反應，再根據產物和底物在化學性質上的差別進行分析，求得單位時間內酶促反應的變化量。
連續法則是基于底物和產物在物理化學性質上的不同，在反應過程中對反應系統添加酶的變性劑以終止反應。常用的連續測定法是光吸收測定法，即根據產物和底物在某一波長或波段上有明顯的特征吸收差別而建立起來的連續觀測方法。幾乎所有的氧化還原酶都可用此法測定，此外如熒光法、旋光法、電化學法也是常用的連續測定方法。
對不易直接測定的反應，可使用酶偶聯分析法，即用過量、專一的“偶聯工具酶”，使被測反應繼續進行到某一可直接測定的階段。
近年來，酶活性的測定工作正向兩個方向發展，一是超微量酶活的靈敏測定，二是實現測定過程的自動化控制。