酶聯免疫吸附實驗—雙抗體夾心ELISA法檢測特異性抗體

雙 抗 體 夾 心 ELISA 法檢測特異性抗體

在有少量酶標特異抗體但無法獲得純化抗原時，用該檢測方法篩選特異性抗體最為有 效（圖 1.1. 4)。另外，這種方法也可利用那些結合同一抗原的不同單克隆抗體來繪制抗原表位圖。

附 加 材 料（其他材料見基本方案）

包 被 抗 體 溶 液（特異性針對待測種屬免疫球蛋白的抗體，不結合抗原或標記抗體）堿性磷酸酶標記的針對抗原的特異性抗體

1.用 50ul 的 2ug/ml 或 lOug/ml 包被抗體溶液包被 Immulon 微量滴定板，并封閉板孔
(見基本方案，步 驟 2?5)。用較低濃度分析雜交瘤上清液或腹水，較高濃度用于分析抗血清。

2.用封閉緩沖液按 1 : 5 或 1 : 200 (V/V) 分別稀釋雜交瘤上清液、抗血清或腹水，配制待測抗體溶液。在已包被孔中加入 50M 1，室 溫 下 孵 育 2 h 以上，洗 滌（見基本方案 ，步 驟 7)。

3.用封閉緩沖液配制 20?200ng/m l 的抗原溶液。往抗體包被孔中加入 50ul 等量抗原溶液 ，室溫下孵育 2 h 以上，洗滌。
4 . 板孔中加入 50/xl 堿性磷酸酶標記的針對抗原的特異性抗體（通 常 是 25?500ng 特異性抗體/ml) ，室溫下孵育 2 h，洗滌。

酶標抗體濃度應足夠高，保 證 NPP 為底物時在 405nm 下產生大約 0 ?5 0 吸光度單位/h 的光強度，或 MUP 為底物時產生 1000?1500 熒光吸光度單位/h。應注意在可得到試劑條件下設置陽性對照系統。

5.每孔中加入 75ul MUP 或 NPP 底物溶液，室溫下孵育 lh。然后，目測檢查酶解作用或用分光光度計定量測定（見基本方案，步 驟 9)。如要檢測低水平反應，酶解作用數小時或數天后再次測定。

6.檢測出的抗原特異性抗體應重新篩選以確定是否為假陽性。每個陽性樣本中，用捕獲抗體包被 4 個板孔，并將待測抗體和包被抗體結合在一起（步 驟 1 和 2)。用抗原孵 育 2 孔（步 驟 3)，另 2 孔用封閉緩沖液封閉， 4 孔 內 都 加 入 酶 標 抗 體 和 底 物（步驟 4 和 5)， Ih 后檢測顯色反應。