酶聯免疫吸附實驗（ELISA）

待檢的人血清

包被液洗滌液磷酸鹽-檸檬酸緩沖液底物溶液終止液酶結合物凍存液的母液應用液

聚苯乙烯微量反應板酶標檢定儀吸管橡皮吸頭等檢測結核菌抗體的 ELISA 試劑盒

實驗所需「試劑」具體見「其他」

1. 包被抗原

用套有橡皮吸頭的 0.2 ml 吸管小心吸取用包被液稀釋好的抗原，沿孔壁準確滴加 0.1 ml 至每個塑料板孔中，防止氣泡產生，置 37℃ 過夜。

2. 清洗

快速甩動塑料板，倒出包被液。用另一根吸管吸取洗滌液，加入板孔中，洗滌液量以加滿但不溢出板孔為宜。室溫放 3 min，甩出洗滌液。再加洗滌液，重復上述操作三次。

3. 加血淸

用三根套有橡皮吸頭的 0.2 ml 吸管，小心吸取稀釋好的血淸（待檢、陽性、陰性血清），準確加 0.1 ml 于對應板孔中，第 4 孔中加 0.1 ml 洗滌液，37℃ 放置 10 min 在水池邊甩出血清，洗滌液洗三次（方法同上）。

4. 加酶標抗體

用吸管沿孔壁上部小心準確加入 0.1 ml 酶標抗體（不能讓血清沾污吸管），37℃ 放置 10 min，同上倒空，洗滌三次。

5. 加底物

按比例加 H₂O₂ 于配制的底物溶液中，立即用吸管吸取此種溶液，分別加于板孔中，每孔 0.1 ml。 置 37℃，顯色 5～15 min（經常觀察），待陽性對照有明顯顏色后，立即加一滴 2 mol/L H₂SO₄ 終止反應。

6. 判斷結果

肉眼觀察（白色背景），陽性對照孔應明顯黃色，陰性孔應無色或微黃色，待測孔顏色深于陽性對照孔則為陽性；若測光密度，酶標測定儀取 λ=492nm，P/n＞2.1 時陽性，P/n＜1.5 陰性，2.1＞P/n＞1.5可疑陽性，應予復査，P/n=(檢測孔 O.D. 值)/(陰性孔 O.D. 值)（用空白孔校 T=100％）。

滴加試劑量要準，且試劑不可從一孔流到另一孔中，每種試劑對應一種吸管，不能混淆，底物溶液中的 H₂O₂ 要臨時用再加。否則，放置時間過長，底物被氧化為黃色，影響試驗結果判定。

在操作過程中切記溢出互混。

試劑：

1. 包被液（0.05 mol/L pH 9.6 碳酸鹽緩沖液）：甲液：Na₂CO₃，5.3 g/L，乙液：NaHCO₃，4.2 g/L，取甲液 3.5 份加乙液 6.5 份混合即成，現用現混。

2. 洗滌液（吐溫酸鹽緩沖液 pH 7.4）：NaCl 8 g，KH₂PO₄ 0.2 g，Na₂HPO₄·12 H₂O 2.9 g，KCl 2 g，吐溫 20 0.5 ml，蒸餾水加至 100 ml。

3. pH 5.0 磷酸鹽-檸檬酸緩沖液：檸檬酸（19.2 g/L）24.3 ml，0.2 mol/L 磷酸鹽溶液（28.4 g Na₂HPO₄/L）25.7 ml 兩者混合后再加蒸餾水 50 ml。

4. 底物溶液：100 ml pH 5.0 磷酸鹽—檸檬酸緩沖液加鄰苯二胺 40 mg 用時再加 30％ H₂O₂，0.2 ml。

5. 終止液 2 mol/L H₂SO₄。

6. 酶結合物凍存液的母液：0.02mol/L PBS pH 7.4，即（1）K₂HPO₄·3H₂O 1.83 g 加蒸餾水至 400 ml，（2）Na₂HPO₄·2H₂O，312 g，加蒸飽水至 100 ml，（1）：（2）＝81：19 混合。

7. 應用液：0.02mol/L PBS pH 7.4，60 ml＋40 ml 甘油＋萬分之一的疏柳汞（也可不加）配成 40％ 甘油液，即為酶結合物凍存液。