酶聯免疫吸附試驗——抗體檢測實驗(ELISA試驗)

該檢測方法比抗原直接結合到固相上的 ELISA 方法敏感性高 2?5 倍（圖 1. 1. 3)。

一、附加材料（其他材料見基本方案）

特異性抗體（單克隆或多克隆）或者來自抗血清、腹水或雜交瘤上清液（單元1.4) 中的免疫球蛋白（單元 1.5，單元 1.7)。

二、實驗方法

1. 用 PBSN 稀釋特異性抗體或免疫球蛋白，配制包被抗體溶液（最終濃度 0.2?10ug/ ml)。

2. 采用十字交叉連續稀釋分析法，確定待檢測抗原濃度所需的包被抗體和酶-抗體結合 物的濃度（見輔助方案），用 PBSN 配制此濃度的包被抗體溶液。

3. 用 50ul 包被抗體溶液包被 Immulon 滴定板，并封閉（見基本方案，步驟 3?5)。

4. 用封閉緩沖液按 1:3 (WV) 連續稀釋（見輔助方案）同源抗原，配制標準抗原的 系列稀釋溶液。使用結合動態范圍大（15%?85%，總范圍是 0.1?1OOOng 抗原/ml) 的稀釋液。

   雖然標準曲線對于精確測定待測樣品中抗原量是必要的，但不需要用于定性檢測。

5. 用封閉緩沖液配制待測抗原溶液的系列稀釋度（通常是 1?1OOng 抗原/ml)。如需 要，測定待測抗原溶液 1?2 個系列稀釋度，確保至少一個稀釋度可以精確測定。

6. 抗體包被孔中加入待測抗原溶液或標準抗原稀釋液（步驟 4)，室溫下孵育 2 h 以上。做 2 或 3 個復孔確保可精確定性測量，快速加入樣品以最大限度減少因孵育 時間不同造成的誤差。

7. 洗滌滴定板（見基本方案，步驟 7)，加入 50ul 堿性磷酸酶標記的特異性抗體（通常是 25?400ng 特異抗體/ml)，室溫下孵育 2 h。

8. 洗滌滴定板，每孔中加人 75ul MUP 或 NPP 底物溶液，室溫下孵育 1h，用微量滴定 板檢測儀檢測。如顯色反應水平低，應在顯色后數小時重新檢測滴定板。

9. 繪制基于標準抗原溶液連續稀釋數據的標準曲線。抗原濃度對數值為 X 軸，熒光度 或吸光度為^軸。用內插法，在標準曲線中求出待測溶液中抗原濃度。