酶聯免疫吸附試驗——抗體檢測實驗(ELISA試驗)6

在測定單一細胞群體的抗原表達水平時，該檢測過程（圖1.1.5）與流式細胞分析 一樣靈敏（單元4.1、單元4. 2）。但在檢測混合細胞時，敏感性不及流式細胞分析。用生物素化的抗體替代酶標抗體，就可轉化為間接方法，而后加入親和素標記的堿性磷酸 酶再次孵育可增加敏感性。

一、附加材料（其他材料見基本方案）

1. 細胞樣品

2. 堿性磷酸酶標記的特異性抗體 V冰冷的洗滌緩沖液

3. 25%（m/V）戊二醛（EM級；Sigma），可選用

4. PBSLE: PBS（附錄1），加100 mmol/L賴氣酸或100 mmol/L乙醇胺，可選用 錐底或圓底微量滴定板

二、實驗方法

1. 使用不同數量的陽性和陰性對照細胞樣品和不同濃度堿性磷酸酶標記抗體，十字交 叉連續稀釋分析法確定每孔添加的最適細胞數和酶標抗體最適濃度（見輔助方案）。開始時以每孔1 X 10^5?5 X 10^5 個細胞和0.5?10 μg/ml 酶標抗體滴定。

   預試驗中僅加入底物孵育，檢測待測細胞本身是否表達堿性磷酸酶。如果表達 量較大，影響酶標抗體的敏感性，則用另一種酶標記復合物，如β-半乳糖苷酶。

2. 使用臺式離心機，將細胞樣品加入 15 ml 或 50 ml 離心管，4°C，450 g 離心 5 min。計 數細胞量（附錄 3A），并用冰冷的洗滌緩沖液重新將細胞混勻，配制成 1 X 10^6?5 X 10^6 個細胞/ml（步驟 3）。

3. 可選：用 0.5%（V/V）戊二醛（終濃度）固定細胞并混勻，室溫下孵育 30 min。離 心沉淀細胞，去上清液，用 PBSLE 重新懸浮細胞，37°C 下孵育 30 min。用 PBSLE 洗滌 2 次并用洗滌緩沖液重新混勻。如需要，可 4°C 下儲存細胞數月。

   如固定后細胞表面抗原仍保持其抗原性，可在實驗開始時就固定細胞。

4. 將 100ul 細胞懸液（1 X 10^5 ?5 X10^5個細胞）加入錐底或圓底微量滴定板孔中， 4°C，450 g 離心 lmin。真空吸去上清液，將微量滴定板置于振蕩器或微量滴定板搖 床上，懸浮沉淀物。

5. 用 100ul 最適濃度的酶標抗體（步驟 1），在冰冷洗滌緩沖液中重新混勻沉淀物。4°C 下孵育 1.5 h，每隔 15 min 柔和搖動微量板重新混勻細胞，注意不要使細胞懸液濺出 孔板。

6. 4°C，450 g 離心細胞 1 min，真空吸去上清液，振搖懸浮沉淀物，加入 200u1 冰冷的 洗滌緩沖液重新將其混勻，重復 3 次。

7. 加入 100ul MUP 或 NPP 底物溶液。室溫下孵育 1 h，顯色過程中，每隔 15 min 柔和 搖動微量板混勻細胞。目測或使用微量滴定板檢測儀（見基本方案，步驟 9）確定顯色程度。