三、ELISA的影響因素
這是ELISA檢測中的重要部分，可從9個方面加以說明。
（一）固相載體：可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進行酶標記測定的基本條件。許多物質可作為固相載體，如纖維素、交聯右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管。由于微量反應板所用試劑量少，操作方便，適合于大規模應用。國產聚苯乙烯微量反應板（上海塑料三廠出品）目前已大量應用于ELISA測定，并且獲得了滿意的結果。但每批微量反應板對抗原或抗體蛋白質的吸附性能是有顯著差別的。實驗證明，吸附效果似乎與塑料的類型及其表面性質有關。特別是塑料制品在加工過程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至完全喪失吸附能力。因此，對每批制品在使用前，必須經過實驗室鑒定，鑒定的方法和標準是對每批購置的微量反應板或塑料管抽樣，用0.2ug/ml純化的正常人IgG進行包被，經洗滌后加酶標記抗人球蛋白進行反應，再經孵育洗滌，加底物顯色終止反應后，逐孔在酶標比色計中測定其消光值、光密度（O.D值）。一般認為全板中每兩孔間O.D值的誤差不超過10%為合格。如果中間孔與四周孔O.D值相差太大，或者反應板的這一邊與另一邊凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格，微量反應板或塑料管在使用前并不一定通過特殊處理。用蒸餾水沖洗即可應用。
（二）抗原：在ELISA中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優質和穩定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫學活性。經試驗證明，適用于其他血清學試驗的抗原并非均適合用于ELISA法。因此，對某一疾病的診斷，必須通過實踐，才能選出適用的優質抗原。對大多數傳染病和寄生蟲病的血清學診斷中所用的抗原并非要求十分嚴格，一般能用于補體結合試驗的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超聲波抗原、凍融抗原、細菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、細菌的外毒素以及用表面活性劑(如SDS)所提取的抗原等，在作ELISA時，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。此外，對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養和雞胚培養物以及病毒接種動物的臟器等，它們當中存在著許多非抗原的蛋白質，必須設法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時選擇的濃度要適當。如濃度太高，則低效價抗體可能測不出來，或包被過量形成多層抗原吸附，故在操作過程中可能脫落從而降低敏感性和可重復性。用最適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經濟，而且可以克服前帶現象。那么用多大濃度抗原進行包被最為合適呢？可通過棋盤滴定法進行測定，但用單項滴定法更為簡便，其方法是將抗原進行一系列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌，再加酶結合物進行反應，經孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應后分別測定O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個抗原稀釋度為最適包被濃度。一般總是要選擇那個O.D值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別。抗原包被固相載體除濃度外，對時間、溫度、PH均有關系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得更加完全且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應板或塑料管作固相載體時，在堿性條件下（如0.1mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時，用PH
7.2-7.4
PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質的濃度為1-10ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20ug/ml較為合適，但均應通過滴定。
（三）試驗樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗樣品（標本）。但應注意分離血清時，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關于人血清在保存過程中抗體的穩定性報導尚不多。但一般認為作ELISA血清最好要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存于低溫冰箱，并防止反復凍融。血漿可用肝素毛細管法采血，而血清可用濾紙片法采血。
被檢血清或血漿標本，可用含保護性封阻劑（吐溫-20）或稱濕潤劑的緩沖液來稀釋。也可加入一些蛋白質，如1%牛血清白蛋白等來稀釋。然后再加到已經用抗原或抗體包被的固相載體中進行孵育。此種被試標本可作一系列稀釋度測定，也可用一個稀釋度測定。對于作某一個傳染病的診斷來說，最好先用一系列稀釋度作一批標本測定，求出對診斷有意義的一個稀釋度（即測定劑量反應曲線），然后用一個稀釋測定即可。最適稀釋度和孵育時間均需從實踐中摸索出來，對一般病原微生物所引起的傳染病的血清學診斷，以1：200稀釋度測定比較適當，而試驗標本的(即含抗體)作用時間一般為室溫或37℃
1-2小時。但現在對有些標本（如流腦抗原）測定時，僅用37℃ 5分鐘。對單克隆抗體檢測也可縮短作用時間。
（四）結合物：在ELISA中，用酶標記的抗體或抗原統稱為結合物，此為進行ELISA檢測的關鍵試劑。常規使用ELISA法的主要問題是能夠簡便地制備酶結合物，而此種制備好的酶結合物要求穩定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產量高及成本低。
用什么樣的酶來標記抗原或抗體呢？可根據以下幾點來選擇適當的酶。
1、酶制品的純度及活力高，催化效力也高，放大倍數大（即一個酶分子能催化幾十幾百個底物分子發生反應的酶）。
2、酶及制備好的酶結合物在檢測或貯存中能保持穩定。
3、酶制劑易得、價廉.
4、既要適用于標記抗原，又適用于標記抗體，標記后不影響抗原或抗體的免疫學特性，也不降低酶的活性。
5、酶的反應產物穩定，檢測時簡便、快速。在定量測定中產物必須是可溶性的。
6、要有安全、價廉、易得的底物。
符合上述條件的酶有：堿性磷酸酶，一般用分子量為5×105（Alkaline
Phospatase,簡稱AP），辣根過氧化物酶（Horse Radish
Peroxidase,簡稱HRP,分子量為4×104）,另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等。其中以前兩種（AP和HRP）最為常用。
AP活力高，制備好的酶結合物可加NaN3防腐，但此種酶不易獲得，因其是從小牛腸粘膜中或大腸桿菌中提取，而且價格比較昂貴。因此，目前國內外大多使用HRP。HRP活性也高，價格較便宜。但制得酶結合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性，但可作低溫保存或加60%緩沖甘油等量混合后少量分裝，保存冰箱，一般可用1-2年。
由于HRP最為常用，故先把HRP的一般性質介紹一下，以便在制備酶結合物時可引起注意。(HRP的性質):HRP系從辣根菜的根中所提取，這種酶是無色酶蛋白與暗棕色的鐵卟NH2啉（E鐵血素）相結合的一種醣蛋白，可簡寫成Fe-E
，由多個（6-7個）同功CH2OH酶所組成。分子量約為40000，等電點為PH7.2。能被58-62%飽和硫酸銨沉淀，在PH3.5-12均較穩定。63℃15分鐘，室溫數周、甲苯和其他苯類有機溶劑處理都不影響它的活性。
由于HRP中的酶蛋白和鐵卟啉分別在波長280nm和403nm有二個最大吸收峰，其兩者的比值，即O.D403nm/O.D280nm稱為RZ值（系由德文Reinnoit-Zah）而來，表示酶的純度。高純度酶制品RZ值可達3.4。而RZ值0.6的酶其中非酶蛋白含量高達75%。不適合作ELISA用，經純化后才能應用。目前我們國產的HRP
RZ值達2.5-3.0，亦可作ELISA用。
抗體：制備酶結合物的抗體最好要提純。被標記的抗體要求效價及親和力都要高，因為純化抗體可增加反應的特異性。如果采用級特異性的酶結合物（例如酶標抗IgM、酶標抗IgG）。有助于區別活動性感染（早期診斷）和已過性感染（追朔診斷）。但在大多數情況下，用抗血清中的全球蛋白成份與酶結合所制成的結合物亦可應用，而且相當穩定。其方法是用硫酸銨沉淀抗血清三次（50%飽和的1次，33%飽和的2次），經透析除鹽，即可用于標記。或者經DEAE-纖維素柱層析后所制成的IgG亦可標記。如將IgG再通過葡聚糖凝膠G-200膠濾（用PH7.2
PBS洗脫）所得純化IgG用HRP標記則更佳。但損失較大，也有人用親和層析法提純抗體來標記的。但在用酶來標記抗體前，需測定一下抗體球蛋白效價和蛋白含量。一般用Beutner氏瓊脂糖散法測效價（即玻片雙相瓊脂擴散法），中央孔加1mg/ml抗原，周圍孔加不同稀釋度粗制或提純抗體（馬或羊抗人IgG），室溫擴散24小時，沉淀反應效價達到1：16以上者即可應用。而蛋白質含量可用751紫外線分光光度計測定，也可用Folin酚法測定。
結合：用什么樣的方法將HRP與抗體球蛋白結合起來呢？當然不能用強烈的方法，因為強烈的方法會使酶和抗體失去活性。故只能用溫和的方法把酶和抗體結合起來。因此，必須使用結合劑。理想的結合劑應具備下列條件：（1）不影響酶及抗體活性，（2）不產生干擾物質，（3）抗體和酶結合后應有較高的產量，（4）不出現非特異性反應,(5)結合程序簡便，（6）來源易、價廉。目前常用的有戊二醛和過碘酸鈉二種。由于對所使用結合劑的針對性，因此標記的方法也有戊二醛交聯法和過碘酸鈉氧化法兩類。
1、戊二醛交聯法：戊二醛是一種能使蛋白質與蛋白質聯結最常用的雙功能試劑。它有2個對稱的活性醛基，可分別與酶蛋白和免疫球蛋白上的游離氨基（酚基、味唑基、巰基）以共價鍵邊接起來而形成的酶結合物。例如酶（Fe-E-NH2CH2OH，）通過戊二醛與免疫球蛋白（Ig-NH2）的交聯反應式如下：
NH2
Fe—E 
CH2OH +OHC-(CH2)3-CHO + H2N-Ig----> Fe-E-N=C-(CH2)3-C=N-Ig+2H2O
H H
酶 低聚醣基團 戊二醛 免疫球蛋白 酶結合物 水
用戊二醛標記又可分為一步法和二步法。一步法主要是將酶、抗體球蛋白和戊二醛同時混合而直接制備。此法雖然簡單，但因酶蛋白的活性氨基少，免疫球蛋白的活性氨基多，在戊二醛作用下，容易形成免疫球蛋白的聚合物，當然也可形成酶蛋白的聚合物。因而，形成酶標記抗體的比例較少，同時抗體和酶的活性喪失較多，結合物的酶活性較低，但較簡便。戊二醛二步法中先用過量的戊二醛與酶作用，使戊二醛上的一個活性醛基先與酶蛋白上的一個氨基結合后，除去過量戊二醛（可通過葡聚糖凝膠G-25過柱或用透析法除去），然后，再加入抗體球蛋白，使之與酶--戊二醛復合物反應，形成酶結合物。而酶結合物的多余醛基可用加入小分子的氨基酸如賴氨酸除去，于穩定酶結合物的特異性。在戊二醛二步法中，酶本身并不產生縮合，因為在第二步酶分子上的一個游離氨基僅與戊二醛上的一個活性醛基聯結，而戊二醛上另一個活性醛基則可與第二步加入的抗體球蛋白分子上的氨基結合生成酶結合物，因此，兩步法優點是能生成均一的酶結合物，大多可使一個分子酶與一個分子球蛋白作用，抗體和酶的活性損失較少，所得酶結合物活性比一步法高10倍左右。
其方法是將10mg
HRP溶于0.2ml含1.25%戊二醛的PH 6.8 0.1mol/L
PBS中，置室溫18小時，充分透析或經葡聚糖凝膠G-25層析除去多余戊二醛，加生理鹽水至1ml，然后加入5mg純化的抗體球蛋白及0.1ml PH
9.6的1 mol/L碳酸鹽緩沖液，混合后于4℃冰箱放置24小時，加入0.1ml 0.2 mol/L的賴氨酸溶液，室溫置2小時，用PH
7.2、0.15 mol/L PBS充分透析，藉離心除去沉淀，上清即為酶結合物。必要時可作進一步純化后使用。
2、過碘酸鈉氧化法：本法是目前酶標記抗體較好的方法，能使70%酶與90%以上球蛋白結合。采用本法首先是用氟代二硝基苯（Fluoro
dinitro bengene
2.4—硝基苯，FDNB）封閉HRP表面的游離氨基（亦可用甲醛或戊二醛來封閉），從而提高酶結合抗體球蛋白的能力，避免酶的自身交聯。然后用過碘酸鈉來氧化HRP表面結構的醣鏈部份（即低聚醣基團）使成醛基，使其直接與抗體球蛋白上的游離氨基形成共價鍵而結合。最后用硼氫酸鈉還原，使HRP表面醛基能充分與抗體球蛋白上氨基進行反應，使之形成穩定的結合物。其反應式如下:
NH2 N=CH2 N=CH2
(1) Fe—E CH2OH +HCHO----> Fe—E CH2OH +H2O
NaIO4
N=CH2 
N=CH2
(2) Fe—E CH2OH +O---->Fe— ECHO + H2O
N=CH2 N= CH2
(3) Fe—E CHO +H2N-Ig---> Fe—E C=N-Ig + H2O
H
其標記步驟是：10mg
HRP溶于新鮮配制的0.3 mol/L PH
8.1碳酸氫鈉2ml中，加0.2ml1%氟代二硝基苯無水乙醇溶液，室溫中攪拌1小時以封閉HRP表面的游離氨基。再加2ml 0.08 mol/L
NaIO4水溶液，于室溫中輕攪30分鐘，用0.16 mol/L乙二醇溶液終止氧化反應。1小時后移入透析袋中置0.01 mol/L PH
9.5的碳酸鹽緩沖液中透析過夜，除去試劑，透析袋中的即為醛化酶。
取6ml醛化酶加20mg抗體球蛋白（用2ml碳酸鹽緩沖液溶解），混勻，室溫攪拌2-3小時后加10mg硼氫酸鈉鹽，4℃冰箱4小時或過夜。次日取出加等量飽和硫酸銨沉淀酶結合物(去游離酶)，并用50%飽和硫酸銨洗滌1-2次。再溶于3ml
PH 7.4 PBS中，并置透析袋經透析除鹽，如有沉淀藉離心除去。上清酶結合物加入等量60%甘油PBS，分裝保存，冰箱備用。