酶聯免疫吸附試驗ELISA方法簡介

近二十幾年來，免疫學分析方法發展很快，特別是在使用標記了的抗原和抗體的分析技術以后，使原來許多經典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技術之后，在70年代初期又建立了用酶來標記抗原或抗體的分析技術。由于酶的高效生物催化作用，一個酶分子在數分鐘內可以催化幾十幾百個底物分子發生反應，產生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數分鐘后就可被識別出來，這種技術被稱為酶聯免疫吸附試驗法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相繼分別報道后，現已引起廣泛重視。
　　ELISA法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用范圍日益擴大，可概括四個方面：
　　1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。
　　2、研究抗酶抗體的合成。
　　3、顯現微量的免疫沉淀反應。
　　4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。　　　　　　
　　二、方法的基本原理和種類　　
　　ELISA的基本原理有三條：
　　（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學活性；
　　（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性；
　　（3）酶結合物與相應抗原或抗體結合后，可根據加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在，而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結果。
　　由于ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學反應的基礎上，因而，具有特異性。而另一方面又由于酶標記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結合物，它可以催化底物分子發生反應，產生放大作用，正因為此種放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一種既敏感又特異的方法。常用的ELISA有以下兩個方面。
　　(一)測定抗原的，主要有四種方法。
　　1、競爭法（Competition method）:方法的基本原理可見圖1：本法首先將特異性抗體吸附于固相載體表面，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個過程，稱為包被（Coated），也可叫做致敏。經洗滌后分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標記抗原，再經孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測定的未知抗原的量。
　　這種方法所測定的抗原只要有一個結合部位即可，因此，對小分子抗原如激素和藥物之類的測定常用此法。該法的優點是快，因為只有一個保溫洗滌過程。但需用較多量的酶標記抗原為其缺點。　　

2、雙抗體夾心法
　　本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結合，經保溫孵育洗滌后，即可加入酶標記特異性抗體，再經孵育洗滌后，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
　　這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。　　

3、改良雙抗體夾心法：本法是雙抗體夾心法的一種改良形式，也是用于測定抗原的，其原理可用圖3來表示。　　
　　本法首先是將特異性抗體a包被于固相載體，經洗滌加入含有欲測抗原之待檢樣品。經孵育洗滌后再加一次未標記的特異性抗體b，而這次加入的抗體b于第一次包被于固相載體上的特異性抗體a對被測抗原來說都是特異性的，但不是用同種動物免疫制備的，否則可出現非特異性反應。經孵育洗滌后，再加酶標記抗b抗體，再經孵育洗滌后加底物顯色進行測定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。同時避免標記特異性抗體，而另一優點是只要標記一種抗抗體，即可達到多種應用。
　　用于測定抗原的尚有第4種叫做抑制性測定法，它是先用抗原包被固相載體，然后分為二組，一組加入用參考抗體和被檢標本混合孵育后的混合溶液，假如標本中不含抗原，則參考抗體未被結合。因此它可以和包被于固相載體上的抗原結合。如標本中含有抗原，則抗原先與參考抗體結合，故參考抗體不再與包被于固相載體上的抗原結合。對加入酶結合物（抗球蛋白）和底物僅顯示剩余結合的抗體量。再與另一組不加待檢標本的參考系統比較，被檢標本對底物顯色的抑制程度與標本中所含抗原量成比例，二者之差，即為欲測抗原的量。　　
　　被檢標本對底物顯色的抑制程度與標本中所含抗原的量成比例，二者之差即為欲測抗原的量。　　
　　(二)測定抗體方面：所用的方法稱為間接法，也是目前最常用的方法
　　間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經洗滌，加入含有被測抗體之標本，再經孵育洗滌后，加入酶標記抗抗體，(對人的標本來說即加酶標抗人球蛋白IgG、IgM)，再經孵育洗滌后，加底物顯色,底物降解的量，即為欲測抗體的量，其結果可用目測或用分光光度計定量測定，本法用不同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲病以及其他疾病的血清學診斷。如用酶標記抗人IgM,則可用于早期診斷。