酶聯免疫吸附（ELISA）實驗

圖1：競爭法測抗原示意圖

本法首先將特異性抗體吸附于固相載體表面，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個過程，稱為包被（Coated），也可叫做致敏。經洗滌后分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標記抗原，再經孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測定的未知抗原的量。

這種方法所測定的抗原只要有一個結合部位即可，因此，對小分子抗原如激素和藥物之類的測定常用此法。該法的優點是快，因為只有一個保溫洗滌過程。但需用較多量的酶標記抗原為其缺點。

血清體液血漿

包被緩沖液抗體球蛋白吐溫檸檬酸硫酸洗滌緩沖液

96孔板酶標比色計移液槍離心管離心管盒

一、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時，貯存冰箱。

二、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 

三、分2組，a組加酶標記抗原和被檢抗原混合液0.2 ml，b組只加酶標記抗原液0.2 ml，37℃作用1～2小時。（混合液可作成不同稀釋度）
 

四、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 

五、加入0.2 ml底物溶液于每個凹孔(OPD或OT)，室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。
 

六、加終止劑：每凹孔加2 M H₂SO₄或2 M檸檬酸0.05 ml。
 

七、用酶標比色計測定a、b兩組OD值，并求出a、b、OD值的差數。

一、影響ELISA的因素

1.  試驗的重復性（精確度）

有二種方法來檢驗試驗的精確度：通常用變異系數來表示：1、幾個樣品用ELISA法同時進行多次測定求出CV%；2、不同時間對不同操作者對某幾個樣進行多次測定求出變異系數。CV是個體參數標準差與平均數的比率。

S / X ＝ CV ，CV應低10%，不應大于10～15%。

不論目測或分光光度計測定，均可作一個稀釋度或一系列稀釋度測定，一般常規診斷只用一個稀釋度判斷陽性或陰性就可以了，這樣比較方便，現在推薦傳染病的血清診斷用1：200一個稀釋度。有些需要精確定量的，可作一系列稀釋度測定。

記錄結果有下列幾種方法：

1、“+”或“-”：所有超過規定的OD值（如OD，0.4）的標本均屬陽性，此規定OD值是根據事先測定大量陰性標本所取得的，此規定值是陰性標本的上限。或者以一組陰性標本OD平均值加2～3個標準差作為陽性閾值。

2、直接以OD值來表示，如0.4、0.7、1.2，OD值越大，陽性反應越強，但此數值是在固定實驗條件下得到的結果，而且每次實驗都要有參考標本作對照。

3、以終點滴度表示：將標本作連續稀釋，最高稀釋度能出現陽性反應者（即OD值仍大于陽性閾值，即為該標本的滴度。

4、以“比值表示：求出被檢標本的OD值與一組陰性標本OD值的比值，例如為陰性標本的2倍或3倍，即為陽性，比值小于2.1而大于1.5為可疑，<1.5為陰性。

測定標本OD值-空白OD值

陰性對照OD值-空白OD值

如在此測定時以空白校正“O”點。

5、以“單位”來表示：在測定被檢標本的同時，再測定一個含已知單位數的陽性參考血清，用不同稀釋度作ELISA檢測后，以OD值為縱坐標，單位數為橫坐標，畫出標準曲線。以后可根據被檢標本的OD值，從曲線上找出相應的單位數，再乘于血清的稀釋倍數，即可得出被檢標本的單位數。

作試驗時的陰性參考血清最好不要顯色，否則會對結果判斷帶來困難，特別在目測時，當陽性標本OD值>2.0時，應作適當稀釋后再作測定。

2.  對使用儀器要求

所用儀器如吸管、燒杯試管都要清潔，用于酶結合和底物的吸管和容器一定要分開。試劑要求標準化。