酶聯免疫吸附（ELISA）實驗

 酶聯免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各種細胞內成份的定位。（2）研究抗酶抗體的合成。（3）顯現微量的免疫沉淀反應。（4）定量檢測體液中抗原或抗體成份。
1 實驗方法原理

   雙抗體夾心法（常用于測定抗原）

    用特異性抗體包被于固相載體，經洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結合，經保溫孵育洗滌后，即可加入酶標記特異性抗體，再經孵育洗滌后，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。

2實驗步驟

一：材料準備

   實驗材料：血清、血漿、體液

   實驗儀器：酶標比色計、96 孔板、移液槍、離心管、離心管盒

    所需試劑及試劑盒：碳酸鹽包被緩沖液、抗體球蛋白、吐溫-20、檸檬酸、硫酸二、實驗操作

    包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度（1～10 μg /ml），每凹孔加 0.3 ml，4 ℃ 過夜，或 37 ℃ 水浴 3 小時，貯存冰箱。

   洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含 0.05% 吐溫-20）洗 3 次，每次 5 分鐘。

   每凹孔加入 0.2 ml 用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標本，37 ℃ 作用 1～2 小時。

   洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含 0.05% 吐溫-20）洗 3 次，每次 5 分鐘。

    加入 0.2 ml 用稀釋緩沖液稀釋的酶標記特異性抗體溶液，37 ℃ 作用 1～2 小時或由預試實驗確定作用時間。

    洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含 0.05% 吐溫-20）洗 3 次，每次 5 分鐘。

    加入 0.2 ml 底物溶液于每個凹孔 （OPD 或 OT），室溫作用 30 分鐘（另作一空白對照，0.4 ml 底物加 0.1 ml 終止劑）。

   加終止劑：每凹孔加 2M H2SO4 或 2 M 檸檬酸 0.05 ml。

   觀察記錄結果：目測或用酶標比色計測定（OPD 用 492 nm）OD 值。

3ELISA 的影響因素

固相載體

    可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進行酶標記測定的基本條件。許多物質可作為固相載體，但在 ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管。

    每批制品在使用前，須經過實驗室鑒定，鑒定的方法和標準是對每批購置的微量反應板或塑料管抽樣，用 0.2 ug/ml 純化的正常人 IgG 進行包被，經洗滌后加酶標記抗人球蛋白進行反應，再經孵育洗滌，加底物顯色終止反應后，逐孔在酶標比色計中測定其消光值、光密度（OD 值）。

    一般認為全板中每兩孔間 OD 值的誤差不超過 10% 為合格。如果中間孔與四周孔 OD 值相差太大，或者反應板的這一邊與另一邊凹孔的 OD 值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽性和陰性參考血清 OD 值是否有明顯差別。一般要求有 10 倍左右的差異為合格。

抗原

    在 ELISA 中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，且要求是優質和穩定的制劑，純度和免疫原性要高。而且抗原包被固相載體除濃度外，對時間、溫度、PH 均有關系。

    溫度高（如 37 ℃、45 ℃、或 56 ℃），包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用 4℃ 包被過夜，可使抗原吸附得更加完全且均勻。