酶聯免疫法在農藥殘留檢測中的應用

　　摘 要：酶聯免疫法（ELISA）是以酶標記抗體或抗原為主要試劑的一種標記免疫分析技術，其結合了抗原抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用，具有靈敏度高、特異性強、準確性好、檢測成本低、迅速等優點，該方法近年來被廣泛應用于食品安全中農藥殘留的檢測。 
　　古語有云：“民以食為天”，隨著人們生活水平的提高和經濟的發展，人們不只是關注食品的口味和營養，而對食品的品質與安全更加重視。如何快速、有效檢測食品中的污染物殘留，確保食品的安全性成為食品行業面臨的重要課題。酶聯免疫吸附技術（ELISA）是在免疫熒光和放射免疫分析技術基礎上形成的一種免疫分析方法。目前用于食品安全檢測的方法有很多，如氣相色譜、高效液相色譜、薄層色譜和質譜等。這些方法準確，但速度慢，且設備昂貴，檢測費用高，難以推廣使用。而酶聯免疫分析法不僅特異性高、靈敏度高、干擾小、簡單迅速、安全性高、不需要昂貴儀器設備，特別適合于對大量樣本的篩檢工作，能廣泛用于多個領域[1]。 
　　1 酶聯免疫法概述 
　　ELISA是1971年Engvell[2]等人建立在免疫酶基礎上的一種新型免疫測定技術，該技術的建立被認為是血清學實驗的一場革命，是令人矚目的有發展前途的一種新技術。20世紀90年代末期，ELISA技術不斷發展以及全自動酶標分析儀的應用，使其特異性與靈敏度有很大提高，在食品檢測領域中的應用大大擴展。 
　　ELISA的基本原理將抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。抗原或抗體再與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，酶作用于底物使其所含的供氫體由無色變成有色，發生顏色反應。因此，可通過底物的顏色變化來判定是否有相應的免疫反應，且顏色反應的深淺程度與樣本中相應抗體或抗原的量呈正比，因此可借助吸光度值計算抗原（抗體）的量，ELISA法可進行定性和定量測定[3]。在上述反應中，酶促反應只進行一次，而抗原一抗體的免疫反應可進行一次或多次。由于酶的催化頻率很高，因此反應效果可被極大地放大，從而使測定方法達到很高的敏感度。這就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性相結合，使ELISA方法成為既特異又敏感的檢測方法[4]。 
　　2 食品中農藥殘留的檢測 
　　農藥殘留是指農藥使用后殘存于食品原料與半成品食品及成品中的微量農藥原體、有毒代謝物、降解物以及雜質的總稱。農藥殘留在人體內積蓄后容易引起慢性中毒，出現神經功能紊亂、精神錯亂、皮膚刺激等癥狀，不容小視[5]。20世紀80年代開始，農藥的免疫檢測技術作為快速篩選檢測方法得到了快速發展。目前幾乎所有農藥類別都建立了ELISA法，檢測樣本以農產品、食品、飼料和環境樣本為主 [6]。 
　　2.1 ELISA抗原與抗體的制備 
　　2.1.1 半抗原的設計和人工抗原的合成 
　　抗原是指能夠引起機體特異性免疫應答，并能與相應抗體發生特異性反應的物質，即同時具有抗原性和免疫原性。具有免疫原性的物質必然具有抗原性，半抗原則是指不具有免疫原性而只有抗原性的物質。半抗原相當于一個抗原決定簇，即只具有抗原性，不具有免疫原性；能與抗體結合，不能誘導機體產生免疫應答。抗原的純凈度會影響到抗體制備的質量，也會間接影響ELISA的效果。因此，制備有良好免疫原性且穩定的人工抗原是ELISA的關鍵環節。農藥分子一般為不含蛋白質的小分子物質，是只具有抗原性的半抗原，不能刺激機體產生免疫反應，只有偶聯到大分子載體（一般為蛋白質）上，才能誘導機體產生抗體。因此首先需要對其進行結構修飾，使之成為可用的半抗原。典型的半抗原結構中應具備適當末端活性基團，如-NH2、-COOH、-OH、-SH等，可直接與載體偶聯；同時活性基團與載體之間應具備一定長度的間隔臂，一般為4～6個碳鏈長度（0.5～0.8nm）；為使形成的抗原具有較強免疫原性，半抗原主體結構中盡可能含有芳香環。另外，半抗原的設計應考慮到農藥樣本和具有毒理學意義的代謝物，針對被測定對象是單一的農藥或某一類農藥，設計中應相應地突出農藥分子的結構或一類農藥分子中共有的結構部分，制成單一的特異性抗體和簇特異性抗體[7]。半抗原修飾好后，在水介質及溫和條件下，與合適的載體蛋白以共價鍵偶聯，使之具有免疫原性，稱之為人工抗原。如果農藥分子上具有反應功能團，那么可根據具體情況用適當的交聯方法與雙功能交聯試劑使半抗原與載體結合。如果是羧基半抗原，可利用羧基通過混合酸酐法或碳二亞胺法等方法；如果是氨基半抗原，則多采用重氮化法或戊二醛法；如果是羥基半抗原，則可直接與丁二酸酐衍生后再與蛋白質交聯；如果是巰基半抗原，則可通過同源或異源雙功能試劑與蛋白質交聯；而酮基半抗原則常用氨基氧乙酸化[8]。如果農藥分子上不具有反應功能團，則需利用化學衍生方法引入制成半抗原，再與載體結合。 
　　不同的農藥應選擇與其相適應的衍生方法，目前常見的是以下方法：用與半抗原結構相似的但具有反應活性基團的化學試劑；對其分子進行改造后使分子內產生羧基基團；在分子內引入元素氯，利用氯原子的活潑性達到所需反應的目的；重新合成半抗原，并在合成過程中選擇適當步驟用一個有反應功能團的分子參與反應，從而合成出有反應功能團的半抗原分子；選擇半抗原的代謝產物來合成人工抗原[9]。 
　　2.1.2 抗體的制備 
　　抗體的制備包括佐劑的選擇、免疫動物的選擇、免疫途徑和抗體特性。一般可采用兩種途徑產生抗體：一是多克隆抗體技術，二是雜交瘤技術生產單克隆抗體。多克隆抗體可用農藥―載體蛋白結合物直接免疫兔子等動物，并從被免疫的動物血清中來獲得。在免疫動物每公斤體重幾十mg到十幾mg范圍內，設定2～3個免疫劑量進行動物免疫。初次免疫時，需加入等量福氏完全佐劑，以提高抗原的免疫原性。一般每隔1周、2周、1個月或2個月在白兔背部皮內或大腿肌肉注射，共計注射8～9次。在最后一次免疫后7天采血測試。當血清抗體達到一定滴度后滅菌采血，離心取血清，在-20℃保存。采用多克隆抗體方法具有生產成本低、方法簡便等優點，但是其抗體的特異性不夠強，會隨著動物種類及個體差異而有變化，易發生交叉反應，生產數量上也會受到一定的限制，不利于批量生產。20世紀70年代發展起來的單克隆抗體技術，發展至今已逐漸成熟。單克隆抗體是指在1株B淋巴細胞系中的每個細胞只能產生1種專有的、針對1種能識別抗原決定簇的抗體。由這樣1株B細胞系產生的抗體即為單克隆抗體。由于該抗體是針對抗原某一決定簇的，因而是一種高特異性抗體。雖然單克隆抗體對設備要求相對較高，技術相對復雜，且成本較高，但是其交叉反應少，特異性強，并且便于批量生產，為生產商品檢測盒提供了極為有利的條件，因此已有學者逐漸轉入研究農藥單克隆抗體的ELISA技術 [10]。國內外對于農藥小分子的免疫分析研究大多集中在針對單個農藥小分子進行的半抗原設計和合成及抗體的制備，即一種抗體只對單一目標化合物有特異性識別和檢測能力，對于多種農藥殘留的研究還很少。 　　2.2 ELISA在農藥殘留檢測中的應用 
　　自20世紀80年代開始把ELISA應用于食品農藥殘留檢測以來，國內外已有大量文獻報道。檢測的食品范圍包括水果、蔬菜、飲料、酒類、魚、肉、豬油、奶、植物油、豆類、谷物及谷物加工產品等。表1列出了國內外有關食品中殺菌劑、除草劑、殺蟲劑等農藥殘留ELISA檢測的一些文獻報道。 
　　3 結論與前景 
　　食品安全檢測的發展方向是快速、靈敏、簡便。ELISA作為固相免疫分析中應用最廣的一種，由于其獨特的優越性已經被廣泛應用于其中。與其他檢測方法相比，ELISA具有高度的特異性和靈敏性，結果準確，重現性好，樣品處理量大，但依然存在著諸多不足。比如，對試劑的選擇性高，對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應，結果易出現假陽性等。不過隨著新的功能材料、新標記技術的發展、界面化學的進步以及新的固相處理技術的應用，相信ELISA會朝著智能化、自動化、微型化方向發展，在未來食品安全的快速檢測中將發揮越來越重要的作用。 
　　參考文獻 
　　[1] 尤敏霞. 酶聯免疫吸附法在食品檢驗中的應用[J]. 河南預防醫學雜志， 2009， （3）： 237. 
　　[2] Engvall E， Perlmann P. Enxyme-linked immunosorbent assay（ELISA） quantitative assay of 
　　immunoglobulin G[J]. Immunochemistry， 1971， 8（9）： 871-874. 
　　[3] 朱正美， 劉輝. 簡明免疫學技術[M]. 北京， 科學出版社， 2002. 
　　[4] 李華林， 邢莉， 張娟. 酶聯免疫吸附試驗的原理、操作方法及注意事項[J]. 養殖技術顧問， 
　　2011， （6）： 182-183. 
　　[5] 馬頎， 任珊， 許美玉. 酶聯免疫吸附技術在食品安全檢測中的應用[J]. 食品科技， 2008， （1）： 200-204. 
　　[6] 劉冰， 魏松紅， 尹曉東等. 農藥殘留酶聯免疫吸附分析技術研究進展[J]. 安徽農業科學， 
　　2007， 35（21）： 6484-6515. 
　　[7] 俎晶晶， 屈凌波， 孫武勇. 甲硝唑人工抗原的制備及其ELISA檢測[J]. 動物醫學進展， 
　　2007， 28（1）： 11-13. 
　　[8] 郭玉蓮， 農藥殘留的酶聯免疫分析技術及研究進展[J]. 農機化研究， 2006， （2）： 201-203. 
　　[9] 李玉珍， 林親錄， 肖懷秋. 酶聯免疫吸附技術及其在食品安全檢測中的應用研究進展[J]. 
　　中國食品添加劑， 2006， （3）： 108-112. 
　　[10] 何方洋， 羅曉琴， 李靜. 酶聯免疫技術在食品安全與藥物殘留中的應用[J]. 現代農業科技， 
　　2009， （15）： 353-354. 
　　[11] 武中平， 徐春祥， 高巍. 酶聯免疫分析法及其在食品農藥殘留檢測中的應用[J] . 江蘇農業科學， 
　　2007， （1）： 198-201. 
　　[12] Kfsouk N， Jerry W K. Superitical fluid extraction and mimunoasay forpesticide detection 
　　inmeatp roducts[ J]. Agr Food Chem， 1994， 42： 1469-1474. 
　　[13] 孫太凡. 酶聯免疫吸附分析技術在農藥殘留分析中的應用[J]. 安徽農業科學， 
　　2010， 38（22）： 11981-11983. 
　　[14] 吳蕓茹. 三種有機磷農藥殘留免疫檢測方法的建立和應用[D]. 南京：南京農業大學， 2008. 
　　[15] 盧希勤. 氰戊菊酯和甲氰菊酯酶聯免疫吸附測定方法研究[D]. 南京：南京農業大學， 2008. 
　　[16] Carsten J， WOLFGANG S. Determination of cut in-bound residues ofch lorothalonil by 
　　Immunoassay[ J]. Agr Food Chem， 2001， 49 （3）： 1233-1238.