釀酒酵母的電穿孔轉化法實驗_電穿孔轉化法

細胞

PEG3350

YPAD 液體培養基渦旋振蕩器

1. 將菌株接種 100 ml 的 YPAD 液體培養基，30℃ 振蕩培養過夜，使細胞滴度達到每毫升 1X10⁸ 到 2X10⁸ 個細胞。

2. 3000 g 離心 5 分鐘沉淀細胞，用 100 ml 滅菌水洗兩遍，加 200 μl 滅菌水重懸細胞沉淀。

3. 加 100 μl 細胞懸液到 50 μl 含有 100~150 ng 需轉化的 DNA 和 20 μg 單鏈載體 DNA 的溶液中，充分混勻。

4. 加 200 μl 50% 的 PEG3350，用渦旋振蕩器快速混勻。

5. 將混合物置于 42℃ 水浴孵育 15 分鐘。

6. 將混合物轉移到冰冷的 0.2 cm BioRad 電穿孔杯中，用帶有脈沖控制器或其他相應設備的 BioRad 基因脈沖器進行電穿孔，條件：1.5 kV、25 μFD、200 Ω。

7. 立即加入 600 μl 冰冷的 YPAD 培養基或滅菌蒸餾水，轉移到一個滅菌的 1.5 ml 微量離心管中，冰浴 5 分鐘。

8. 離心 2 秒沉淀細胞，用室溫的 YPAD 培養基或滅菌蒸餾水洗一遍，重懸于 1 ml 的 YPAD 或滅菌蒸餾水。

9. 取 2、20、200 μl 涂布 SC 減樣選擇培養基平板，30℃ 培養 3~4 天。