| 實驗方法原理 | 混合蛋白質樣品中各種蛋白質的等電點不同, 在pH8 . 6 的巴比妥緩沖液中, 各種蛋白質所帶的靜電荷量不同, 加上蛋白質分子大小不相同, 在電場中移動的速度也不等, 例如, 血清或卵清樣品中白蛋白等電點比其他蛋白質低, 在pH8 . 6 時帶的負電荷比其他蛋白質多, 加上白蛋白的分子較小, 因此在電場中比其他蛋白質移動速度快。這樣, 樣品中的蛋白質在醋酸纖維素膜上就可以形成區帶, 可以分離和分析蛋白質組成等。另外, 作為純化了的蛋白質電泳后的區帶應是一種, 否則就沒有純化好。醋酸纖維素膜是對纖維素的羥基進行乙酰化而得的, 將其溶于有機溶劑( 丙酮、氯仿、氯乙烯、醋酸乙脂等) 后抹成一均勻薄膜, 則成醋酸纖維素膜, 它有強滲透性, 對分子移動無阻力,作為區帶電泳的支持物進行蛋白質電泳具有簡便快速、樣品用量少、應用范圍廣、分離清晰、沒有吸附現象等優點。蛋白質與氨基黑10B 特異結合而不與醋酸纖維素膜結合,染色一段時間后脫色, 膜上沒有結合蛋白質的部位就不呈色, 有蛋白質的部位就顏色明顯。 |
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| 實驗步驟 | 1. 膜的準備: 將醋酸纖維素膜切成8 cm×2 cm 條塊( 或根據需要決定薄膜大小) , 在薄膜一端1 . 5 cm 處用鉛筆輕輕畫一條線( 點樣處) , 浸入巴比妥緩沖液中至完全浸濕( 大概20 min 左右)。用鑷子取出浸透的薄膜, 夾在兩層濾紙中間, 輕輕按壓,吸去多余的液體。
2. 點樣: 用較尖的血色素吸管或其他點樣管吸取樣品2～3 μl 涂在玻片的一端截面上(玻片寬度應小于膜寬度) , 然后將沾有樣品的玻片截面與膜點樣處輕輕接觸, 樣品即呈一條線“印” 在膜上, 使樣品盡量點得細窄而均勻。
3. 電泳: 已點好樣品的薄膜架在鋪有濾紙橋的電泳槽上,使點樣端靠近陰極, 膜用鑷子輕輕拉平不能貼在槽底。蓋好槽蓋, 通電, 控制電流強度為0 . 7 ～ 0 . 8 mA/ cm 膜寬, 當白蛋白(仔細觀察可見淡黃色) 移動約3 cm 即可切斷電源停止電泳, 一般為40～60 min。
4. 染色和漂洗: 取下膜, 立即浸入染色液中10 min。取出移入2 . 5%醋酸中漂洗脫色, 每隔5 min 換一次漂洗液, 直至膜背景無色為止( 約更換3 次) , 即可觀察到清晰的電泳圖譜。
5. 透明處理: 待漂洗干凈的電泳圖譜完全干燥后( 可用電吹風機吹干) , 浸入透明液中0 . 5 min 后, 立即取出, 平貼在玻璃板上, 完全干燥后即成為透明的薄膜圖譜, 可作掃描或照相。如將該玻板浸入水中, 則膜脫下, 吸干水分, 可長期保存。
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