采用PACE分析RNA肽相互作用實驗

低放射性標記物 RNA 底物

TBE 凝膠儲存緩沖液 電泳緩沖液 丙烯酰胺儲存液 過硫酸銨 考馬斯亮藍

聚丙烯酰胺凝膠電泳設備 PACE 凝膠 層析紙 塑料膜 凝膠干燥器 暗盒

一、材料與設備

1. 標準聚丙烯酰胺凝膠電泳設備，包括電源、電泳槽、夾子、熱槽（1/8 英寸厚的鋁板）。

2. 寬而短的凝膠，因為寬的凝膠可以包含更多的濃度梯度，短的凝膠可以減少每個聚丙烯酰胺條需要的肽量，一般尺寸為 24 cm X 36 cm 或 26 cm X 36 cm( h X w )，凝膠的實際尺寸并不是至關重要的，在具體應用時這個操作程序同樣可以在其他尺寸的凝膠應用。

3. 針對 PACE 凝膠，梳子和墊片要進行一定的切割，如圖 11.5 所描述對梳子和墊片進行切割，切割以后的凝膠可以包括 10 個肽濃度。



4. 10 ml Luer 注射器，25 gage 針頭，手套和石蠟膜。

5. 低放射性標記物。

6. 層析紙，塑料膜和凝膠干燥器。

7. 暗盒，X 射線片和顯影劑。

8. 放射物質定量儀器。

9. 5X TBE 凝膠儲存緩沖液和電泳緩沖液：450 mmol/L Tris 堿，450 mmol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。

10. 40% 丙烯酰胺儲存液（29：1，丙烯酰胺：甲叉甲雙丙烯酰胺）。

11. 10% 過硫酸銨（API 水溶液（m/V），99% TEMED。

12. ³²P 標記的 RNA 底物，PACE 可以使用 3'，5' 或者內部標記的 RNA。可以采用標準的程序制備 RNA 樣品，如果僅有痕量濃度的 RNA 上樣到 PACE 凝膠，則要求高的放射活性（> 200 dμm/fmol）。

13. 制備并純化肽或者蛋白。因為 PACE 測定非常敏感，高純度和精確濃度的肽是最基本的要求，一般采用反向高效液相色譜（PR-HPLC）或其他的高精度的純化方法進行純化，蛋白或肽溶液要用水或合適的儲存緩沖液進行系列稀釋。儲存液通常配制為 100X，在使用時稀釋 100 倍。

14. RNA 樣品稀釋到 6X 的 Ⅲ 型上樣染料中：0.24% 溴酚藍，0.24% 的二甲苯青 FF，30% 的甘油水溶液。

15. 考馬斯亮藍蛋白染色：0.24% 考馬斯亮藍，45% 甲酵的 10% 冰醋酸水溶液，用來標定 PACE 電泳的時間。

二、試驗方法

1. 檢測

(1) 用去污劑仔細清洗每個凝膠板并用水沖干凈，然后再用乙醇淋洗，理想硅化板可以保證灌注后凝膠混合物均勻分布。如圖 11.6 所示安裝凝膠板、梳子和墊片，將其旋轉 90°。滑動取出上部的墊片（S）創造一個灌膠的空隙，在 B 和 P 相對的毎個缺口的頂部之間畫線，標定每個肽濃度凝膠的灌注高度，標記每個道并記錄所使用的肽儲存液濃度。



(2) 制備 200 ml 凝膠混合物：0.5X TBE，15% ( 29：1）丙烯酰胺，0.02% 的過硫酸銨（20 ml 5X TBE 儲存液，75 ml 40% 的丙烯酰胺儲療液，400 μl 10% 的 AP，104.6 ml 重蒸水）。使用時添加鹽（Na⁺，K⁺，Mg²⁺ 等）、去污劑或其他緩沖液成分到合適的終濃度。為了快速完全聚合，使用真空抽氣機進行脫氣，直到不強烈的產生氣泡。如果使用去污劑，要在脫氣以后加入，凝膠混合物終體積為 200 ml。

(3) 去除注射器的活塞，用石蠟膜封住針筒下部的孔并保持豎直，加入 70.7 μl 100X 肽儲存液（或緩沖液，在肽濃度為 0 的凝膠條使用），加入 7 ml 的凝膠混合物，14 μl 的 TEMED，用手指緊緊的封住針筒的末端，將活塞輕輕地推回到針筒的適當位置，將注射器倒轉使針孔向上，讓氣泡升到上部，移開手指和石蠟膜，不要將注射器指向自己，因為可能會有少量的凝膠混合物噴出，推動活塞直到它完全進入針筒內，然后再堵住針孔。反復顛倒注射器數次以便混勻凝膠混含物，移幵手指推動活塞使氣體溢出針筒，直到凝膠混合物剛好要溢出。

(4) 安裝 21 gage 針頭，緩慢的將凝膠從裝置的頂部空隙灌注到兩個玻璃板之間，直到凝膠達到第一個切口之間的畫線。

(5) 等待 10 min 以便凝膠進行聚合，在等待的同時，取出注射器，丟棄剩余的混合液到適當的容器。用蒸餾水洗滌注射器和針頭以便下一次使用，注意要確保沒有殘留的水。

(6) 凝膠聚合完成后，用一條寬度剛好能夠插入到玻璃板之間的 Whatman 紙在兩個板中間滑動，吸出上層的未聚合的凝膠溶液。

(7) 重復步驟 (4)~(6)，依次改變凝膠中肽的濃度灌注標號為 1~8 的凝膠條。

(8) 減少凝膠底部與墊片 S 之間的空隙并灌注最后的凝膠條（ 標號為 9）。傾斜裝置，以使凝膠溶液流向底部的灌膠梳子，等 10 min 以便凝膠聚合。

(9) 如圖 11.7 將裝置放平，在灌膠梳子一端稍抬起（大約 5 cm）。去除凝膠梳子，用 Whatman 紙將剩余的未聚合凝膠吸除干凈。



(10) 配制 7 ml 肽濃度為 0 的凝膠混合物，加入 14 μl TEMED，然后灌膠直到凝膠混合物到達頂部板的邊緣，再加入 1 ml TEMED，插入梳子，聚合 15 min。

(11) 去除底部的墊片及梳子，將灌好的膠裝到電泳槽。

(12) 在電泳槽中加入 0.5% TBE 緩沖液（添加鹽或去污劑），洗滌上樣孔和去除底部墊片后的空隙，不必進行預電冰，將 RNA 樣品加到適當的上樣孔，上樣孔一般只能上 2 μl 的樣品。

(13) 凝膠應該在恒定的低電壓下進行電泳，以盡量減少熱的產生，21 cm X 36 cm 大小，0.8 mm 厚的凝膠在 3W 的條件下（不考慮鹽的濃度）可以得到好的分離效果，電泳的吋間控制在 RNA 和肽剛好不跑出凝膠。

(14) 電泳結束后取下凝膠裝置，移去一塊電泳玻璃板，用塑鈄膜蓋住凝膠，在塑料膜上標記每個泳道的肽濃度，將凝膠從另一個板上剝離，轉移到塑料膜上，用 Whatman 紙覆蓋凝膠。

(15) 在凝膠干燥器里干燥 1 h，粘上兩點發光的標簽作為參照，凝膠對底片曝光適當的時間。

(16) 進行底片顯影，使其干燥，利用發光標簽將凝膠和底片對齊，在含肽的區域和加樣孔區域的交界面做標記，測量從該處到每個條帶中央的距離，或者是到條帶底部的距離 ( 條帶有拖影或者跨越了兩個道的分界時），重要的是在一個試驗中要采用一致的測量方法。