采用PCR技術插人表位標記物

   許多表達載體可能沒有能夠克隆標記物的合適的限制性酶切位點。在這種情況下，采用PCR技術將多肽標記物插入到已經克隆化的開放閱讀框。在設計PCR正向和反向引物時，可引入較長的片段以在蛋白的氨基或羧基末端引入多肽標記物。，選擇用于編碼標記物特定氨基酸的密碼子，使其能夠用于表達標記蛋白的生物系統中。引物設計時應加入新的限制性酶切位點，以便PCR產物的克隆。應在引物限制性部位5^，端添加額外的堿基，這些“增添”的堿基有利于限制酶對PCR產物進行有效的切割。同時需注意保持正確的閱讀框和根據需求設計起始密碼和終止密碼子。使用Kozak的保守翻譯起始序列5^，—CCACCATGG-3’代替單一的ATG起始密碼，可在真核細胞中進行有效的翻譯。稍為復雜的PCR程序可以將肽標記物為一個閱讀框內融合蛋白形式，插入到開放閱讀框的任何一個部位。這些技術在許多克隆手冊中均有描述，在此僅給出一個簡單的例子以說明應考慮的因素。

    舉例：采用PCR技術將HA標記物插入到周期素（cyclin）結合蛋白的氨基末端并在正。coli中表達

    設計PCR的正向引物（氨基末端HA標記物）有3個目的：

    （1）編碼HA標記物；

    （2）與周期素結合蛋白YFP2開放閱讀框的5，端雜交；

    （3）創建新的限制性酶切位點以便將編碼新的標記蛋白的PCR產物克隆到表達載體中。

當標記氨基末端時，需要創建一個新的起始甲硫氨酸以避免破壞正確的翻譯起始信號。如果克隆到真核系統中進行表達，則需在此處引入Kozak保守序列，在本例選用（pET-5a）作為表達質粒。

    1．表位標記物的序列

    Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

     Y   P   Y   D   V   P   D   Y   A

    選擇E．coli和人類常用的密碼子。

    TAC CCA TAC GAC GTG CCA GAC TAC GCT

選擇一段重疊序列，將標記物置于YFP2的氨基末端。通常有18～21bp的重疊序列即可。希望Tm溫度在55～80℃之間，盡可能避免連續3個C或G，且避免引物在3，端互補或者具有明顯的二級結構。可使用軟件程序進行正確的引物設計。但是，一個簡單的經驗是，每對AT提供2℃熔鏈溫度，而每對GC提供4℃熔鏈溫度。

    2．YFP2的氨基末端

    ATG GAC CCG GCG GCG GGG AGC

     M   D   P   A   A   G   S

    然后再創建限制性酶切位點。在本例中，所創建的位點并不在開放閱讀框中：本例選擇創建一個NdeI酶切位點，以編碼起始甲硫氨酸和有利于克隆到表達載體中。同時，添加GC以利于對PCR產物進行有效的限制性消化和防止PCR產物末端的破裂。

    GC CATATG

    結合上述要素，設計正向引物，預定以下寡核苷酸

    5^，—GC CATATGTAC CCA TAC GAC GTG CCA GAC TAC GCT ATG GAC CCG GCG GCG GGGAGC-3^，

反向引物可設計成為開放閱讀框的末端引物，并創建一個適當的限制性酶切位點。

    3．YFP2在羧基端的序列

    GGT CCC TCA GAC ATC CCC GAT TGA

     G   P   S   D   I   P   D   x

    4．因與基因的該區域雜交并創建一個在片段另一端進行克隆所需EcoRI酶切位點的反向引物

    GC GAA TTC TCAATC GGG GAT GTC TGA GGG ACC

    為使用現有的編碼YFP2基因的質粒作為模板進行PCR，需要根據所使用的具體設備，仔細地進行優化，以設計合適的反應條件；這些優化程序可以參見Dieffenbach和Dveksler（1995）的文獻。

如果得到大小正確的產物，就可將產物從凝膠中切下，使用PCRprepDNA純化系統進行純化，然后以EcoRI和NdeI進行限制性消化，并連接到經過適當處理的載體上去。在本例中，克隆到可在正．coli中表達的且含有合適酶切位點的pET-5a載體上。NdeI部位提供了起始甲硫氨酸。

    5．新的氨基端

    M Y P Y D V P D Y A M D P A A G S。。。

    |————一標記物——一|——YFP2——