重組人蛋白細胞因子的研究選擇—細胞因子

1．重組蛋白表達體系

MCE 重組蛋白表達體系主要有：大腸桿菌，酵母細胞，昆蟲細胞和哺乳動物細胞。

2．重組蛋白純度和濃度測定

重組蛋白純度測定方法：a. SDS-PAGE 測定法；b. HPLC 測定法；c. 銀染測定法。

重組蛋白濃度測定方法：a. Bradford 蛋白定量測定法；b. BCA 蛋白定量測定法；c. SDS-PAGE 蛋白定量測定法。

3．重組蛋白表達體系對比     

4．重組蛋白表達體系選擇

5．重組蛋白開蓋使用前處理

為防止凍干粉產品的粉末沾在管壁或管蓋上，使用前請勿開蓋，離心(約13000 rpm)處理 20-30 秒，使附于管蓋或管壁的蛋白收集于管底。MCE 保證每管產品的蛋白總量達到標示含量。

6．重組蛋白復溶

a. 使用前先離心(約 13000 rpm)處理 20-30 秒，使附于管蓋或管壁的蛋白收集于管底。

b. 嚴格依據說明書，使用推薦的溶液將蛋白凍干粉溶解至推薦的濃度。大多數重組蛋白建議溶解在滅菌超純水中，濃度不低于 100 μg/mL，以便于后續進一步稀釋至工作濃度。

c. 用移液槍輕吹混勻，或將管蓋蓋好后輕柔顛倒數次進行混勻，低速離心數秒。

d. 復溶后的重組蛋白在室溫放置數分鐘，以保證蛋白能夠充分溶解。

7.重組蛋白儲存

由于每次凍融都會造成蛋白的部分變性，因此建議客戶收到產品后適量分裝避免反復凍融。

a. 短期儲存：

凍干粉狀態產品在室溫下存放 3 周，不影響活性。復溶后的產品在 4℃ 可穩定儲存 1-2 周。

b. 長期儲存：

凍干粉狀態產品在 -20℃ 下，可穩定保存至少一年；推薦 -80℃ 長期保存，以獲得更穩定性能的產品。可選擇包含一定濃度載體蛋白(0.1% BSA， 5% HSA， 10% FBS，或 5% 海藻糖)的溶液或培養基復溶產品，分裝后凍存于 -20℃ 下，可保存至少三個月；推薦 -80℃ 長期保存，以獲得更穩定性能的產品。

注：分裝凍存時，蛋白濃度不低于 100 ng/μL，且每管的體積不可小于 20μL。

8.重組蛋白標簽影響

蛋白標簽指重組蛋白制備過程中與目的蛋白融合表達的蛋白或多肽。MCE的重組蛋白產品大部分為無標簽狀態，但少數重組蛋白產品因為不同目的需要加有標簽。

a. 標簽利于蛋白純化。

b. 當目的蛋白無特定抗體直接鑒定，可利用標簽進行 Western Blot 或ELISA 分析方法鑒定。

c. Fc 標簽可以提升重組蛋白的半衰期以提高分子的穩定性，同時也能夠促進重組蛋白形成活性二聚體。

重組蛋白標簽對蛋白的生物學活性影響存在未知結論，但對大部分檢測應用中，重組蛋白的標簽對蛋白本身生物學活性并無影響，所以無需移除。MCE 對重組蛋白產品都已經做過生物學活性檢測并將數據公示于 COA 中。

9. 重組蛋白活力值與計算方法

MCE 重組蛋白的生物學活性 (ED50) 測定數據在 COA 中可以獲得。ED50 是Effective Dose 50 的縮寫，是可誘導 50% 最大反應的蛋白濃度 (ng/mL)。

計算公式如下:

MCE 的重組蛋白產品并未采用 WHO (National Institute for BiologicalStandards and Control) 設定的標準來測定活力值，以上計算公式并不適用于“International Units”和“ED50”的轉換關系，需要采用國際標準品對比相同實驗獲得該重組蛋白的 IU 值。

10. 重組蛋白 ED50 值的批間差

不同批次的產品或不同實驗方法的測定都會導致重組蛋白產品的 ED50 值變化，我們推薦客戶根據自己的實驗測定得到最合適的實際 ED50 值。

11. 重組蛋白應用方案

MCE 重組蛋白產品的 COA 中顯示的實驗方案只是確認該產品的 ED50 值，但并不與終端客戶的不同類型實驗結果存在等效性。如果客戶需要應用在不同于本公司產品測試的實驗方法時，我們建議客戶通過實際測試獲得最佳 ED50 值。

12.重組蛋白的種屬交叉活性

重組蛋白的種屬交叉活性需要根據具體產品而定；建議盡量選擇對應種屬的重組蛋白。如實在無法匹配種屬，以下信息供參考：

a. 大多數人細胞因子對小鼠細胞有效 (僅少數例外)。

b. 多數小鼠細胞因子對人細胞有效，但特異性可能不強。如小鼠的表皮生長因子(EGF)對人的表皮細胞有活性，對人的其他種類細胞可能也有作用。

c. 干擾素、GM-CSF、IL-3、IL-4 具有種屬特異性，即重組人的這些細胞因子只能作用于人細胞，對小鼠和大鼠等其他種而重組小鼠的這些細胞因子也僅用于小鼠，對人的細胞無效。

d. 成纖維細胞生長因子 (FGFs)、神經營養素 ( Neurotrophins，如 BDNGF、GDNF、CNTF、β-NGF 等)、TGF-β 等高度保守，各種屬間交叉活性強。