重組的果蠅NAP－1的表達和純化實驗1

晚對數期的懸浮培養的SFP細胞

高滴度的 His－NAP－1 桿狀病毒儲液（Orbigen）磷酸緩沖鹽溶液（PBS）裂解緩沖液 H洗滌緩沖液 H洗脫緩沖液 HHEGD 緩沖液NAP－1 純化緩沖液 Ni－NTA牛血清白蛋白（BSA）標準乙醇液氮

離心機Wheaton 杜恩斯勻漿器MWCO 透析管FPLC裝置

1.實驗前準備

1.1材料

晚對數期的懸浮培養的SFP細胞（＞2×10⁶ 細胞/ml）

1.2 試劑

高滴度的 His－NAP－1 桿狀病毒儲液（Orbigen）

磷酸緩沖鹽溶液（PBS），冰冷

裂解緩沖液 H

洗滌緩沖液 H

洗脫緩沖液 H： 含有 480 mmol/L 咪唑的洗滌緩沖液 H

含有 0.1 mol/L NaCl 的 HEGD 緩沖液

含有 0.0、0. 1、1.0 mol/L NaCl 的 NAP－1 純化緩沖液

牛血清白蛋白（BSA）標準，2 mg/ml （Pierce， Cat.No.23209）

Source 15Q 樹脂（Amersham Pharmac1a B1otech）

20％ （V/V）乙醇

8％ 和 15％ SDS-PAGE 凝膠

液氮

1.3 耗材

Ni－NTA 瓊脂糖樹脂（Qiagen）

帶有傾斜斗轉子的臨床離心機，4℃

適用于臨床離心機的 250 ml 圓錐形離心瓶

40 ml Wheaton 杜恩斯勻漿器，A 型研磨棒

Sorvall Superspeed離心機，帶有 SS-34 轉子（或相當的物品）

15 ml和 50 ml 錐形管

直立圓筒旋轉混合器

12 000～15 000 MWCO 透析管

HR－5 或 HR－10 FPLC 柱（Amersham Pharmac1a B1otech） FPLC裝置

硅烷化的 1.5 ml 聚丙烯管子（如 ISC B1oExpress， Cat.＃ C－3302－1）

2. Sf9 細胞在 500 ml 或 1000 ml 旋轉式培養瓶中生長至 ＞2.0×10⁶ 細胞/ml。用培養基稀釋至 1.0×10⁶ 細胞/ml。每升細胞培養液使用 25 ml 擴增的 His－ NAP－1 病毒感染。

3. 感染 72 h 后，4℃，在 250 ml 錐形瓶中使用臨床離心機 2000 r/min 離心 5 min 收集 細胞。用冰冷的 PBS 重懸細胞（0.1 體積的原細胞培養體積）。重復離心。

從這一步開始，除非明確指出，在冰上或冷室進行所有的操作，所有的溶液都應為 4℃。細胞沉淀可以在液氮中速凍并在進一步的操作前于 -80℃ 保存幾周。

4. 用裂解緩沖液 H（1/40 原細胞培養體積）重懸細胞。在 Wheaton 杜恩斯勻漿器中使用 A型研磨棒在 30 min 時間里勻漿 40 次。4℃，14 500 g （SS－34 轉子 11 OOOr/ min） 離心 10 min。將所有的上清液集中到一個 50 ml 錐形管中。

5. 每 500 ml 原細胞培養體積取 1 ml Ni－NTA 瓊脂糖樹脂在裂解緩沖液 H 中平衡。加入細胞抽提物，并在直立圓筒旋轉混合器上孵育 3～4 h。使用臨床離心機 4℃， 2000 r/min 離心 5 min 收集樹脂。用 100 ml 裂解緩沖液 H 洗滌樹脂兩次，然后用 100 ml 洗滌緩沖液 H 洗滌樹脂兩次，每次加入緩沖液后，顛倒管子重懸樹脂，每次洗滌后，在臨床離心機中 2000 r/min 離心 3 min 收集樹脂。

6. 用 2 ml 洗脫緩沖液重懸樹脂，輕輕振蕩以洗脫蛋白質。冰浴 5 min。在臨床離心機中 2000 r/min 離心 3 min， 將上清液轉移到冰上的新的管子中。重復洗脫循環 3 次 以上，將洗脫液集中到一起。

7. 將洗脫的 NAP－1 在 12 000～15 000 MWCO 透析管中對 4L 含有 0.1 mol/L NaCl 的 HEGD緩沖液進行透析 2 次，每次 2 h。

8. 對 4L 含有 0.1 mol/L NaCl 的 NAP－1 純化緩沖液再透析 2 h。

9. 將透析好的溶液轉到 15 ml 錐形管中，4℃，14 500 g （SS－34 轉子 11 000 r/min） 離心去除沉淀。將透析好的 NAP－1 蛋白與 BSA 標準同時進行 SDS-PAGE 電泳分析，以估計蛋白質的數量。

10. 使用 FPLC，根據操作規程將 Source 15Q 樹脂裝入 HR－5 或 HR－10 柱。每 5 mg 步驟 8 中的 NAP－1 裝柱 1 ml 樹脂。用 10 倍柱體積的含有 0.1 mol/L NaCl 的 NAP l 純化緩沖液平衡 Source 15Q 柱。

11. 將 NAP－1 上樣到 Source 15Q 柱上。用 10 倍柱體積的含有 0.2 mol/L NaCl 的 NAP－1 純化緩沖液洗滌樣品。用 20 倍柱體積的含有 0.2～0.5 mol/L NaCl 梯度的 NAP－1 純化緩沖液洗脫蛋白質。

早期的峰（低鹽）對組裝有抑制作用，而晚期的峰（高鹽）卻可以激活。14 kDa 的條帶（見第 8 步）與早期的峰（抑制作用）一起被洗脫出來。收集 0.25～0.5 柱體積的組分。

12. 每個組分各取 2 ul 進行 15％ SDS－PAGE 凝膠電泳以確定含有純的 NAP－1 的組分。將蛋白峰合并后透析兩次，每次對 2L 含有 0.1 mol/ L NaCl 的 NAP－1 純化緩沖液透析 2 h。

13. 將透析好的 NAP－1 蛋白與 BSA 標準同時進行 8％ SDS－PAGE 電泳分析，確定蛋白質的濃度。將得到的溶液分裝于 1.5 ml 硅烷化的管子中，每管 100～200 ul，并用液氮速凍，保存于-80℃。