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  • 發布時間:2019-07-31 23:02 原文鏈接: 重組片段的轉化及克隆和篩選

    一、目的與原理
    轉化是指以質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。轉化技術在基因工程領域中占有極重要的地位。目前用得較多的轉化技術為將人工構建的重組質粒到如受體細胞,使重組質粒在受體細胞中穩定地復制和表達。
    二、材料和方法
    1.材料:大腸桿菌
    2.儀器:
    離心機,恒溫搖床,恒溫水浴,超凈工作臺,冰柜
    3.試劑
    LB培養基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ; 
    TFB:10mM MES(pH 6.3),45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl
    三、操作步驟
    1. 感受態細胞融化(在手心)
    2. 加入溶于TE的待轉化外源DNA,冰浴30min。
    3. 42℃熱沖擊2 min。
    4. 冰上2min。
    5. 加入0.4 ml LB液體培養基,37℃保溫搖床45 min
    6. 取0.2ml菌懸液涂布在含氨芐青霉素、IPTG、X-gal培養基上,37℃培養。
    四、實驗結果及分析:
    培養皿上有白色菌落和蘭 色菌落,但蘭色菌落數量很少。由于受體細胞本身的菌落為蘭色,所以白色菌落說明轉化成功;蘭色應為轉化不成功。但是由于轉化的質粒經過了酶切和連接,若是在原酶切位點的連接進行的轉化,菌落為白色;若為酶切去一段DNA的的連接質粒進行的轉化,菌落為蘭色(說明在酶切上成功,連接上也成功,轉化上也成功)。
    五、注意事項
    關鍵要嚴格控制熱激時間,超過2min,則轉化會失敗。

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