| 實驗材料 | 轉染細胞溶解產物 BS-C-1／HuTK-143B／BHK-21／CEF 貼壁生長匯片的細胞 |
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| 試劑、試劑盒 | 完全 2 × 噬斑培養基-5 完全MEM-2.5培養基 篩選試劑 LMP 瓊脂糖溶液 5-溴脫氧尿苷溶液 中性紅溶液 X-gal溶液 X-gluc溶液 干冰／乙醇 |
| 儀器、耗材 | 6孔 35 mm 組織培養板 杯狀超聲儀 45℃水浴鍋 無菌巴斯德吸管（帶棉花濾芯） |
| 實驗步驟 |
實驗試劑準備詳見「其他」。 1. 胰酶消化單層培養的細胞，用適當的完全培養基懸浮細胞。 1.1 對 XGPRT 篩選、噬斑選擇或顏色篩選，用 BS-C-1 細胞。 1.2 對 TK 篩選，用 HuTK-143B 細胞。 1.3 對于 MVA，用 BHK-21 或 CEF 細胞。 2. 用血球計數器對細胞計數（附錄 3F）。 3. 按 5 ×105 細胞/孔將細胞加到 6 孔培養板中（最終 2 ml/孔），培養生長至匯片（所需時間少于 24 h）。 4. 按以下方法制備細胞。 4.1 對于 XDPRRT 篩選，在含 1/400 體積 10 mg/ml MPA、1/40 體積 10 mg/ml 黃嘌呤和 1/670 體積 10 mg/ml 次黃嘌呤且經過濾除菌的完全 MEM-2.5 培養基中， 預培養 12～24 h。 4.2 對于噬斑或 TK 選擇或顏色篩選的方法，則不需要預培養。 5. 使用前將 100 μl 的轉染細胞溶解產物和 100 μl 的 0.25 mg/ml 的胰酶混合，渦旋混 勻。在 37℃ 水浴中溫育 30 min，溫育過程中每隔 5～10 min 渦旋一次，然后在冰上超聲 20～30 s。對于 MVA，可以不用消化，但要超聲 20～30 s 以打散結團。 6. 在 MEM-2.5 完全培養基中對胰酶消化和（或）超聲處理的細胞溶解產物進行 4 次 10 倍的系列稀釋 （稀釋范圍為 10-2~10-4）： 6.1 對于 XGPRT 篩選，按步驟 4.1 所述的濃度加入 MPA、黃嘌呤和次黃嘌呤。 6.2 對于噬斑或 TK 選擇或顏色篩選的方法，則不需要加。 7. 將培養單層細胞的培養基吸出（來自步驟 3），用每孔 1 ml 稀釋溶解物的劑量去感染細胞（10-2～10—4）。培養 2 h，每隔 30 min 搖動一次。 8. 在 2 h 感染完成之前，溶解適當體積的 2％ LMP 瓊脂糖（1.5 ml × 孔的數量），在 45℃ 水浴中冷卻（在用瓊脂糖覆蓋細胞之前保證它確實已經冷卻到 45℃）。將以下 物質加入到 2 × 完全噬斑培養基-5 以制備所需的適當數量的噬斑選擇培養基 （1.5 ml × 孔的數量），并加熱到 45℃。 8.1 對于 XGPRT 篩選，按步驟 4.1 所述濃度的兩倍加入 MPA、黃嘌呤和次黃嘌呤。 兩倍濃度是必需的，因為 2 × 完全噬斑培養基-5 將和瓊脂糖按 1 : 1 的比例混合。 8.2 對于 TK 篩選，加入 1/100 體積的 5 mg/ml BrdU。 8.3 對于噬斑或顏色篩選的方法，則不需要加。 9. 通過等體積混合 2％ 的 LMP 瓊脂糖和步驟 8.1 或 8.2 制備的噬斑選擇培養基制備適當的選擇瓊脂糖。 10. 將接種的病毒溶液從被感染的細胞中吸出（來自步驟 7），用 3 ml 適當的選擇瓊脂糖覆蓋細胞，在室溫或 4℃ 讓瓊脂糖凝固。培養 2 天。 11. 通過等體積混合 2％ 的 LMP 瓊脂糖（1 ml × 孔的數量，按步驟 8 融解并冷卻至 45℃） 和含 1/100 體積 10 mg/ml 的中性紅的 2 × 完全噬斑培養基-5 （每孔 1 ml， 加熱至 45℃） 制備第二層覆蓋瓊脂糖。如果使用 β-半乳糖篩選，則要向瓊脂糖/噬斑培養基中加入 1/120 體積的 4％ X-gal。如果使用 GUS 篩選，則加入 1/100 體積 的 2％ 的 X-gluc。用 2 ml 的這種第二層覆蓋瓊脂糖覆蓋每孔細胞，讓其凝固，過夜培養。 12. 向無菌離心管中加入 0.5 ml MEM-2.5 完全培養基。當溫育周期結束后，用一無菌有棉花濾芯的巴斯德吸管伸入到瓊脂糖中挑取分離較好的噬斑。刮下單層細胞，將瓊脂糖塊吸入吸管中，轉移到含有 0.5 ml MEM-2.5 完全培養基的管中。用新的吸 管重復挑選 6～12 個噬斑放于不同的小管中。 13. 渦旋每個含病毒的小管，用反復凍融的方法裂解小管中的病毒：用干冰/乙醇凍結， 37℃ 水浴、渦旋解凍。如此進行 3 次。 14. 將其置于冰水上，在杯狀超聲儀上以最大功率超聲 20～30 s。如果只是用 TK 進行篩選，則應用 PCR 方法、DNA 點雜交或免疫染色進行驗證分離的噬斑，因為有些噬斑含有自發的 TK- 突變而不是重組病毒。 15. 按照步驟 1～4 所述的方法制備適當的貼壁培養的單層細胞。每個噬斑的分離需要一塊 6 孔板。 16. 對每個分離的噬斑做 10-1、10-2、10-3 3 個 10 倍系列稀釋（步驟 6）。 如果用 XGPRT 進行篩選，則需要用篩選藥物進行預培養，做系列稀釋時也應含有篩選藥物（步驟 4）。 17. 吸出培養基，用 1 ml 病毒稀釋液感染細胞，每個稀釋度感染兩孔。培養 2 h，每隔 30 min 用手輕輕搖晃一次。 18. 重復步驟 8～14 的操作，進行三輪或更多輪的噬斑純化，確保得到單克隆的純化重組病毒。
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| 注意事項 | |
| 其他 |
試劑： 完全MEM-2.5培養基 篩選試劑（對于 XGPRT 篩選；抽濾除菌，-20℃ 保存）： 10 mg/ml （400 ×）麥考酚酸（MPA； Calblochem），溶于 0. 1 mol/L NaOH； 10 mg/ml （40 ×）黃嘌呤，溶于 0. 1 mol/L NaOH； 10 mg/ml （670 ×）次黃嘌呤，溶于 0.1 mol/L NaOH 2％ 的 LMP 瓊脂糖（LifeTechnologies）水溶液，高壓滅菌 完全 2 × 噬斑培養基-5 5 mg/ml 5-溴脫氧尿苷（BrdU），溶于水（用于 TK 篩選；過濾除菌，-20℃ 保存） 10 mg/ml 中性紅溶液，溶于水 4％ X-gal 溶液，溶于二甲基甲酰胺（可選，用于半乳糖苷酶篩選；） 2％ X-gluc 溶液，溶于二甲基甲酰胺（可選，用于 GUS 篩選） 干冰/乙醇
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