重組蛋白的表達與純化

實驗概要

本實驗將重組大腸桿菌經過誘導培養后，獲得了表達的重組蛋白，分別用Ni-NTA柱親和層析、High Q與DEAE陰離子交換層析、Glutathione柱親和層析進行了層析純化，并進行了濃縮。

實驗步驟

1. 將測序正確的質粒轉化Rosetta(DE3)菌，過夜培養后，挑取單菌落，于小試管內進行IPTG誘導實驗，即37℃培養至OD₆₀₀為0.6后，加入1mM IPTG，37℃繼續培養3h。將全菌液收集后破碎，SDS-PAGE電泳檢測，選取表達量高的單菌落進行大量表達。

2. 將含有flotillin-2質粒的Rosetta(DE3)菌，接種至含氨芐的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜，以0.2%接種于自動誘導培養基中，37℃培養至OD為0.6。降溫至20℃，培養過夜。

3. 離心收集菌體，用300mL離心管，6000g離心10min。將菌體懸浮于相應的裂解緩沖液中，洗滌一次，用300mL離心管6000g離心10min，再次將菌體懸浮于預冷的相應的裂解緩沖液中，體積為培養基體積的1/5。

4. 超聲波破碎細菌，控制功率為200W。工作條件為超聲4s，暫停lose 90次，以冰浴降溫。若還有塊狀物或者沉淀，可再重復一次。在4℃以20000g高速離心30min收集上清，保存于-20℃或立即進行層析純化。

    1) Ni-NTA柱親和層析

配制如下溶液：

His6裂解緩沖液(用于裂解含His6 Tag的重組蛋白)50mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0；I0mM imidazole；150mM NaCI；0.1% TritonX-100；10%甘油；使用前加入PMSF，使其終濃度為200ug/mL；

His6洗滌緩沖液(用于洗滌含His6 Tag的重組蛋白)

50mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0；20mM imidazole；150mM NaCI；0.1% TritonX-100；10%甘油；使用前加入PMSF，使其終濃度為200ug/mL；

His6洗脫緩沖液(用于洗脫含His6 Tag的重組蛋白)

50mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0；200mM imidazole；150mM NaCI；0.1% TritonX-100；10%甘油；使用前加入PMSF，使其終濃度為200ug/mL；

將表達有目的蛋白的Rosetta菌用His6裂解緩沖液溶解，超聲破菌，離心，取上清以1 mL/min泵送至His6裂解緩沖液預先平衡的Ni-NTA Superflow層析柱(l0mL，15X1cm)，His6裂解緩沖液洗滌至基線水平后，再用3倍柱體積(30mL )的His6洗滌緩沖液洗滌，最后用1倍柱體積(10mL)的Hiss洗脫緩沖液洗脫。

    2) High Q與DEAE陰離子交換層析

配制如下溶液：

A溶液l0mM Tris-HCl緩沖液，pH 7.5；

B溶液1M NaCI溶解于l0mM Tris-HCl緩沖液，pH 7.5；

用溶液A平衡20mL體積(l0X 1.6cm)的DEAE-Sepharose CL-6B層析柱，流速為1 mL/min，至OD₂₈₀。基線水平后，將含目的蛋白上清液(低鹽)泵送過柱，流速為1 mL/min，泵送完畢后，再次用溶液A洗滌層析柱至基線水平，開始用溶液A和溶液B形成線性梯度，流速為1mL/min，B溶液從0%至100%的梯度總體積為100mL。分步收集器每2mL收集一管洗脫液。

    3) Glutathione柱親和層析

配制如下溶液：

GST裂解緩沖液(用于裂解和洗滌含GST Tag的重組蛋白)

50mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0；5mM EDTA；150mM NaCI；0.1% Triton X-100；濕熱滅菌；使用前加入PMSF，使其終濃度為200ug/mL。

GST洗脫緩沖液(用于洗脫含GST Tag的重組蛋白)

50mM L-Glutathione (reduced form)；50mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0(將0.0896gGlutathione溶解于10mL緩沖液后，需要用NaOH調節pH值)；5mM EDTA；150mM NaCI；0.1% Triton X-100；使用前加入PMSF，使其終濃度為200ug/mL。

將表達有目的蛋白的Rosetta菌用GST裂解緩沖液溶解，超聲破菌，離心取上清以2mL/min泵送至GST裂解緩沖液預先平衡的Glutathione Sepharose 4B層析柱(5mL，15X0.7cm)，GST裂解緩沖液洗滌至基線水平，最后用1倍柱體積(10mL)的GST洗脫緩沖液洗脫。

5. 純化蛋白質超濾濃縮

將得到的高純度蛋白質洗脫液進行排阻離心超濾，通過排阻孔徑合適的超濾管離心將蛋白滯留在超濾管膜上，讓緩沖液通過膜離，自去除，以達到濃縮的效果。方法為：挑取SDS-PAGE電泳檢測純度和濃度相對較高的蛋白質洗脫液，加入超濾管中5000rpm，4℃條件下離心20min，去除收集管內的濾出液后在向管內加入新的蛋白質洗脫液并吹打混勻管內蛋白質以避免蛋白質局部濃度過高而沉淀，每次吸取超濾管內蛋白質進行Bradford法濃度測定(以l0mg/m1BSA作為參照的標準蛋白)，超濾至蛋白管內蛋白質總量約10mg左右。此后加入5-10ml的5mMTris-HCl ( pH8.5 )緩沖液進行超濾以稀釋蛋白質溶液，去除可能影響結晶的多余的鹽分及其它離子，超濾過程中離心時間以每次離心至超濾管內液面低于1ml刻度線為準，然后重新加入新的5mM Tris-HCl緩沖液，此過程重復5-6次。最后超濾至20mg/ml左右(大約至超濾管內剩下500ul溶液)，然后將溶液混勻后分裝(50uI一管)后用液氮速凍于-70℃保存待結晶。