摘要： 可以在蛋白質水平和目的基因功能水平等各個層次鑒定重組子。可以在 蛋白質 水平和目的基因功能水平等各個層次鑒定重組子.基因水平的鑒定有酶切鑒定、 PCR 鑒定、核酸雜交和基因序列分析等.蛋白質水平鑒定有插入失活雙 抗生素 對照篩選(例如 Tet r 和 Amp r )和插入失活 LacZ' 基因的藍白斑篩選等.表達載體可進行插入方向鑒定和表達產物的免疫學和生物學活性鑒定.一般重組質粒鑒定主要按照表型篩選、酶切鑒定和測序鑒定的順序進行.
(一)插入片段長度鑒定
1、酶切鑒定
由表型鑒定從平皿中挑取單克隆,在液體培養基中擴增,制備質粒. 質粒 可能以線性、開環和閉環超螺旋等 3 種形式存在.盡管這 3 種形式的質粒分子量一樣,但是它們的電泳速度不一樣,電泳時可能會出現 2-3 條帶.用設計的內切酶進行酶切后電泳,如果載體中有插入的目的基因,電泳出現兩條帶,一條是載體,另一條是目的基因；反之,電泳后就只有一條載體帶.在一 塊膠上同時設分子量標記、空質粒等對照,就可以看出載體中是否有插入片段以及插入片段的大小.酶切鑒定是克隆鑒定的第一步.如果酶切電泳條帶與設計相符, 可以初步確定目的基因插入了 載體 ,下一步就是進行測序鑒定.
2、PCR鑒定
現在很多載體克隆位點兩側存在恒定的序列,例如 T 7 和 SP 6 啟動子 ,針對這種序列的 PCR 引物 可以很方便地從專業公司購買或者合成.有時插入基因本身就是 PCR 產物,實驗室已有這些引物.對所挑選的菌落中的質粒進行 PCR 擴增以鑒定是否有插入片段以及插入片段的大小.例如 T-A 克隆載體,克隆位點兩側有 T 7 、 SP 6 和 M 13 啟動子通用序列,用 PCR 鑒定就非常方便.但是多數實驗室更喜歡用酶切鑒定。
(二)插入片段方向性鑒定
如果需要
基因表達
,必需鑒定外源基因在重組質粒中的連接方向.這對于在克隆時使用單酶切位點的情況尤為重要.可以利用聯合酶切方案進行目的基因的插入方向鑒
定.在基因插入的鄰近末端部位選擇一個單酶切點( B ),在載體上選一個單酶切點( A
),用這兩個內切酶分別酶切兩份重組質粒,正、反兩個方向的插入將產生不同大小的 DNA
片段,通過凝膠電泳即可鑒定插入片段方向是否正確.
(三)DNA序列測定
用酶切初步鑒定正確的重組質粒需要進一步作測序鑒定,測序完全正確的重組質粒才可以進行下一步實驗.盡管很多單位都有 DNA 測序儀,但是一般的基因工程實驗室并不自己測序.因為國內很多專業 生物工程 公司提供測序服務,方便快捷,收費合理.它們一個反應可以測定 500-700bp ,其中前 500 bp 可以保證極高的正確性.
DNA序列測定技術是建立在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的基礎上,可以區分1個堿基的差異.對于一個待測序列的 DNA 片段,先將其轉變成一系列的放射性核素標記的單鏈寡聚核苷酸,以使其一端為一固定的末端,而另一端由于長度不一,成為一系列相差 1 個堿基的連續末端.在建立的4種反應體系中,寡聚核苷酸分別終止于不同的位置的A、T、G或C堿基.4種反應體系的寡聚核苷酸產物,在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣于相鄰的加樣孔進行電泳分離.
由于全部可能產生的不同大小的寡聚核苷酸都存在于 4 種反應產物中,故從放射自顯影后的 4 種末端寡聚核苷酸梯子形圖譜中就可以直接讀出 DNA 的順序.由于技術的發展,現在多數情況下使用 熒光標記 ,這樣不僅安全環保,而且速度更快.