實驗概要
本技術以pBS質粒、E. coli DH5α為例介紹了重組質粒的連接、轉化及篩選。
實驗原理
本實驗所使用的載體質粒DNA為pBS，轉化受體菌為E.coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因，故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補現象篩選相結合的方法。
因pBS帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因，故轉化受體菌后只有帶有pBS DNA的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來；而只帶有自身環化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。
pBS上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點，但并沒有破壞lacZ的閱讀框架，不影響其正常功能。E.coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下，pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現互補的現象叫α-互補。由α-互補產生的Lac 細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到pBS質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變，表達蛋白失活，產生的氨基酸片段失去α-互補能力，因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養基上，α-互補產生的Lac 細菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養基中的乳糖，產生乳酸，使pH下降，因而產生紅色菌落，而當外源片段插入后，失去α-互補能力，因而不產生β-半乳糖苷酶，無法分解培養基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質粒與自身環化的載體DNA分開。此為α-互補現象篩選。
主要試劑
1. 連接反應緩沖液(10×)：0.5mol/L Tris?Cl (pH7) 6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌)，500μg/ml 牛血清清蛋白(組分V) Sigma 產品)(可用可不用)，10mol/L ATP(過濾滅菌)。
2. T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase)；購買成品。
3. X-gal儲液(20mg/ml)：用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲液，包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞，儲存于-20℃。
4. IPTG儲液(200mg/ml)：在800μl蒸餾水中溶解200mg IPTG后，用蒸餾水定容至1ml，用0) 22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲于-20℃。
5. 麥康凱選擇性培養基(Maconkey Agar)：取52g麥康凱瓊脂加蒸餾水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50mg/ml，然后搖勻后涂板。
6. 含X-gal和IPTG的篩選培養基：在事先制備好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal儲液和4μlIPTG儲液，用無菌玻棒將溶液涂勻，置于37℃下放置3-4小時，使培養基表面的液體完全被吸收。
7. 感受態細胞制備相關試劑。
8. 煮沸法快速分離質粒相關試劑。
9. 質粒酶及電泳試劑。
主要設備
恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養箱，電泳儀無菌，工作臺，微量移液槍，eppendorf管。
實驗材料
外源DNA片段：自行制備的帶限制性末端的DNA溶液，濃度已知；
載體DNA： pBS質粒(Ampr ，lacZ)，自行提取純化，濃度已知；
宿主菌： E.coli DH5α，或JM系列等具有α-互補能力的菌株。
實驗步驟
1. 連接反應
1) 取新的經滅菌處理的0.5ml eppendorf管，編號。
2) 將0.1μg載體DNA轉移到無菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA片段。
3) 加蒸餾水至體積為8μl，于45℃保溫5分鐘，以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。
4) 加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl， T4 DNA ligase 0.5μl，混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底，于16℃保溫8-24小時。
同時做二組對照反應，其中對照組一只有質粒載體無外源DNA；對照組二只有外源DNA片段沒有質粒載體。
2. E.coli DH5α感受態細胞的制備及轉化
每組連接反應混和物各取2μl轉化E.coli DH5α感受態細胞。具體方法如下：
1) 從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。
2) 加入pBS質粒DNA溶液(含量不超過50ng，體積不超過10μl，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。
3) 42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。
4) 向管中加入1ml LB液體培養基(不含Amp)，混勻后37℃振蕩培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
5) 將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37℃培養16-24小時。
同時做兩個對照：
對照組1：以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。
對照組2：以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。
3. 重組質粒的篩選
1) 每組連接反應轉化原液取100μl用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養基上，37℃下培養半小時以上，直至液體被完全吸收。
2) 倒置平板于37℃繼續培養12-16小時，待出現明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出平板。
3) 放于4℃數小時，使顯色完全(此步麥康凱培養基不做)。
不帶有pBS質粒DNA的細胞，由于無Amp抗性，不能在含有Amp的篩選培養基上成活。帶有pBS載體的轉化子由于具有β-半乳糖苷酶活性，在麥康凱篩選培養基上呈現為紅色菌落。在X-gal和ITPG培養基上為藍色菌落。帶有重組質粒轉化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性，在麥康凱選擇性培養基和x-gal和ITPG培養基上均為白色菌落。
4. 酶切鑒定重組質粒
用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液體培養基中，37℃下振蕩培養12小時。使用煮沸法快速分離質粒DNA直接電泳，同時以煮沸法抽提的pBS質粒做對照，有插入片段的重組質粒電泳時遷移率較pBS慢。再用與連接未端相對應的限制性內切酶進一步進行酶切檢驗。還可用雜交法篩選重組質粒。
注意事項
1. DNA連接酶用量與DNA片段的性質有關，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。
2. 在連接帶有粘性末端的DNA片段時，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時，需加入DNA濃度至100-200mg/ml。
3. 連接反應后，反應液在0℃儲存數天，-80℃儲存2個月，但是在-20℃冰凍保存將會降低轉化效率。
4. 粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應溫度為37℃，在連接粘性末端時，反應溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。
5. 在連接反應中，如不對載體分子進行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段(2-5倍)，這將有助于減少載體的自身環化，增加外源DNA和載體連接的機會。
6. 麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當抗生素時，攜有載體DNA的轉化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落。該產品篩選效果同藍白斑篩選，且價格低廉。但需及時挑取白色菌落，當培養時間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，影響挑選。
7. X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導物，它可以誘導lacZ的表達。
8. 在含有X-gal和IPTG的篩選培養基上，攜帶載體DNA的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養后放于冰箱3-4小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。