金屬螯合親和層析實驗（二）

蛋白質

GuMCAC-EDTA緩沖液鹽酸胍

轉子離心機

1.  制備表達帶組氨酸尾的融合蛋白的大腸桿菌菌體沉淀。

2.  準備NTA介質層析柱，但柱子最后以GuMCAC-0緩沖液洗滌.

3.  在冰浴中凍融菌體沉淀。加5 ml GuMCAC-0緩沖液，用吸管抽吸重懸，超聲破菌或勻漿。在-70℃凍結10 min，室溫凍融。

4.   用振搖器、旋轉混合器或磁力攪拌器輕柔地混勻樣品60 min，在4 ℃ 27 000 g 離心30 min 將上清吸至一個干凈的容器并棄沉淀。取10 μl 小份樣品留待SDS-PAGE分析。

5.  如果提取液被凍結，室溫凍融，以10~15 ml/h 的流速上Ni²⁺-NTA柱。收集流出液，取10 μl 小份樣品留待SDS-PAGE分析。

6.  以20~30 ml/h 的流速用5 ml GuMCAC-0緩沖液洗柱，棄流出液。

7.  以分段冼脫的方式分別依次以5 ml 下列緩沖液冼柱：GuMCAC-20、GuMCAC-40、GuMCAC-60、GuMCAC-80、GuMCAC-100、GuMCAC-500。分部收集每1 ml 洗脫液，保留待SDS-PAGE。
 

8.  在10~15 ml/h 的流速下以5 ml GuMCAC-EDTA緩沖液洗柱，收集每1 ml 級分。

9.  確定含蛋白祥品的組分，合并之。將祥品透析或保存于-70℃。

10.  準備合適的最終蛋白溶解溶液（如用于蛋白質切割斷裂或長期保存），并加入鹽酸胍至4 mol/l 終濃度。在4℃對1 000 ml 該含4 mol/l 鹽酸胍的緩沖液透析2 h 以上。

11.  倒出500 ml 上述含胍的緩沖液，再加入不含胍的緩沖液，重復透析。

12.  將透析袋移至1 000 ml 不含鹽酸胍的新鮮緩沖液，4℃透析2 h 或過夜。

13.  從透析袋中取出蛋白溶液，分裝成小份，在-70℃或液氮中凍結。

14.  分析各分部收集的級分并處理蛋白。